Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil (2)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
KEEMIAINSTITUUT
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL0060 Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö
3.3 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Üliõpilane
Matrikli nr
õpperühm
Juhendaja:
Tallinn 2011
Töö teoreetilised alused:
Bioloogilistes vedelikes kasutatakse glükoosisisalduse määramiseks enamasti ensümaatilist meetodit. See põhineb kahe ensüümi – glükoos oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel .
GOD on substraadispetsiifiline β,D-glükoosi suhtes (tänu sellele võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust teiste taandavate suhkrute juuresolekul).
GOD (β,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas) katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GOD on liitvalk (flavoproteiin) ja sisaldab prosteetilise grupina (mittevalguline komponent ) flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koensüüm.
FADi abil kantakse glükoosi molekulilt kaks H aatomit hapnikule, selle tulemusel glükoos oksüdeerub glükoonhappeks ja tekib FADiga ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi.
POD ( doonor , H2O2-oksüdoreduktaas) osaleb reaktsiooni järgmises etapis . POD on samuti liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem.
POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks.
Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetril.
Töö käik:
Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis (greibimahl).
Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas.
Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes.
Uuritava proovi (greibimahla lahjendus) ettevalmistamine:
Valmistasin greibimahlast 1:100 lahjenduse. Selleks pipeteerisin automaatpipetiga 0,5 ml pigistatud greibi mahla 50 ml kolbi, täitsin kolvi kriipsuni destilleeritud veega ning loksutasin segamini.
Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks:
Valmistasin 1,0 mg/ml kontsentrasiooniga glükoosi lahusest 3 lahjendust: 0,25, 0,125 ja 0,062 mg/ml. 0,25 mg/ml lahjendus: pipeteerisin puhtasse katseklaasi 2,5 ml glükoosi standardlahust ja lisasin dest. vett 7,5 ml, panin katseklaasi korgi peale ja loksutasin. Pipeteerisin esimest lahjendust 5 ml teise katseklaasi, kus oli juba 5ml destilleeritud vett ning loksutasin, nii sain 0,125 mg/ml lahjenduse. Teisest lahjendusest pipeteerisin 5 ml kolmandasse katseklaasi, kus oli samuti 5 ml destilleeritud vett ning loksutasin. Sain kolmanda lahjenduse, 0,062 mg/ml.
Reaktsiooni läbiviimine (toatemperatuuril):

Markeerisin 6 kuiva ja puhast katseklaasi ja asetasin need statiivi.

Katseklaas nr. 1: pipeteerisin sinna 1 ml destilleeritud vett (kontrollproov, mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni).

Katseklaasid nr. 2 ja 3: 1 ml greibimahla lahust (paralleelproovid).

Katseklaasid nr. 4,5 ja 6: pipeteerisin igasse katseklaasi 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust.

Pipeteerisin igasse katseklaasi 3 ml tööreaktiivi ja loksutasin koheselt. Fikseerisin aja ja hoidsin katseklaase 20 min toatemperatuuril.

Katseklaasides olevad lahuses värvusid suuremal või vähemal määral kollakaks, see toimus K3[Fe(CN)6] toimel ja näitas glükoosi olemasolu.

Mõõtsin spektrofotomeetril (lainepikkus 410 nm) lahuste optilised tihedused destilleeritud vee vastu.

Kuna ka kontrollproov andis madala optilise tiheduse väärtuse (tööreaktiivi komponentide tõttu), lahutasin glükoosi sisaldavate lahuste (katseklaasid 2-6) optiliste tiheduste väärtustest kontrollproovi oma).
Kaliibrimisgraafiku koostamine:
katseklaas
Optilised tihedused, lainepikkus 410 nm
Korrigeeritud optilised tihedused
nr. 1: kontrollproov (dest. vesi)
0,037
nr. 2: greip I
0,059
0,022
Keskmine
0,0235
nr. 3: greip II
0,062
0,025
nr. 4: glükoosilahus (konts. 0,25 mg/ml)
0,173
0,136
nr. 5: glükoosilahus (konts. 0,125 mg/ml)
0,101
0,064
nr. 6: glükoosilahus (konts. 0.062 mg/ml)
0,070
0,033
Saadud andmete põhjal koostasin graafiku (x- teljel glükoosi kontsentrasioon (C), y-teljel sellele vastav ABS). Graafik peaks olema koordinaatide alguspunkti läbiv sirge (korrektne katse).
Leian graafikult lahjendatud greibimahla glükoosisisalduse
ABS=0,0235, seega C=0,044 mg/ml
Arvutused:
X=C*L*10-3*d*100= 0,044*100*10-3*1,044008*100=0,459%
C-glükoosisisaldus greibilahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule- 0,044 mg/ml
L- lahjendustegur - 100
d- greibimahla tihedus- 1.044008 g/cm3
Kokkuvõte
Antud greibimahl sisaldas 0,46% glükoosi. Kirjandusest (wikipedia) leidsin vaid sellised andmed, et valge greip sisaldab 1,7 g glükoosi 100g kohta, see teeks 0,017% mis on võrdlemisi väike suurus võrreldes minu tulemusega.
Kasutatud kirjandus
Praktikumi juhend,
http://www.aqua-calc.com/page/density-table/substance/Grapefruit-blank-juice-coma-and-blank-white-coma-and-blank-raw
Wikipedia
Töö teostatud: