Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (alkalaas) (0)

Sissejuhatus:
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid . Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alustades toiduvalkude seedimisest ja lõpetades väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadidega.
Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs).
Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid:
• Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2 ≠ Pro)
• Kümotrüpsiin (R1 = Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2 ≠ Pro)
• Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 ≠ Pro)
Samas aga paljud bakteriaalsed proteaasid, nagu subtilisiin, savinaas, alkalaas jt omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid.
Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud proteaasid kuuluvad endopeptidaaside rühma. Eksopeptidaaside esindajateks on karboksüpeptidaasid (R2 = C- terminaalne aminohape ) ja aminopeptidaasid (R1 = N-terminaalne aminohape), mis lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid.
Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH ≈ 2,5), neutraalseid (pH ≈ 7,2) ja leelisproteaase (pH ≈ 9,0).
Oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on aktiivtsentri ehitus (millised aminohapped sellesse kuuluvad) ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism. Siinkohal piirdume vaid nelja peamise rühma nimetamisega, süüvimata nende toimemehhanismide erinevustesse: seriin-, tiool -, aspartaat- ja metalloproteinaasid.
Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 μkat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 μmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 μmooli aminohapete vabanemise1 s vältel 30°C juures.
Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, siis ongi üldlevinud, et proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide, st aminohapete ja peptiidide hulga kaudu.
Töö käik:
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi
toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide
sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.

Uuritavaks proteaasiks on alkalaas, millest ma valmistasin 5ml lahust kontsentratsiooniga 1,5 mg/ml.

Võtsin 25 ml mahuga suure katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiinilahust, mille pH on reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Klaasi katsin korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 °C juurde umbes 5–10 minutiks

Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja nummerdasin. Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust

Termostaadis olevevale kaseiinilahusele lisasin ensüümi ning märkisin reaktsiooni alguse aja üles.

Peale ensüümi lisamist võtsin puhta kuiva pipetiga võimalikult kiiresti 3 ml reaktsioonisegu ning viisin TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0- proov ) ja loksutasin. Reaktsioonisegu asetasin tagasi termostaati.

5 minuti ja 45 sek pärast võtsin sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja loksutasin. Samas asja kordasin veel kaks korda 5-minutiliste intervallidega.

Jätsin proovid settima 15 minutiks ning filtreerisin iga proovi ümber.

Spektrofotomeetril mõõtsin proovide optiliste tiheduste väärtused lainepikkusel λ = 280 nm.
Saadud tulemused, koos optilisele tihedusele vastavate türosiini sisaldustega on alljärgnevas graafikus :
Optiline tihedus, A
Türosiini sisaldus, mg/ml
Aeg, sek
0,210
0,033
0
0,280
0,045
345
0,361
0,057
645
0,426
0,067
945
Ensüümipreparaadi proteolüütilise aktiivsuse leian alljärgneva valemiga:
ΔCTyr = 0,067 – 0,045 = 0,022
A= (0,022*1000*26*5*2)/(600*181*1*0,0076)=6,930 μkat/g
Järeldus:
Tulemust 6,930 μkat/g võib tõlgendada nii, et 1g esperaasi hüdrolüüsib 30˚C juures 1 sekundi jooksul 6,930 μmol peptiidsidemeid. Kirjanduse andmetel on alklaas nüüd laiemalt tuntud subtilisiini nime all, mille aktiivsus olenevalt pH-st ja päritoluorganismist vahemikus ~6 - 9,5 μkat/g. Minu tulemus langeb sellesse vahemikku. Võrreldes paljude teiste proteolüütiliste ensüümidega on ta üsna madala aktiivsusega ensüüm ning ühe μmooli peptiidi hüdrolüüsimiseks on vaja üsna suurt kogust nimetatud ensüümi.