Proteaasi aktiivsuse määramine (0)

1 Hindamata

Töö teoreetilised alused
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide või vabu aminohappeid . Proteaasid on väga levinud kõikides organismides, kuna nad osalevad paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises.
Proteolüütilistel ensüümidel on erinevad toimespetsiifikad, osad lõhustavad vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid, teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele.
Piiratud proteolüüsi viivad läbi näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin ja pepsiin, praktiliselt kõiki peptiidsidemeid valkudes lagundavad subtilisiin, savinaas ja alkalaas ning produtseerivad sellega ka vabu aminohappeid.
Eristatakse endo - ja eksopeptidaase vastavalt sellele, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid, neutraalseid ja leelisproteaase.
Oluliseks proteaaside kvalifikatsiooni aspektiks on aktiivtsentri ehitus ning sellest tulenevalt ka ensüümi toimemehhanism.
Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulka ei saa otseselt mõõta, siis proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide ehk aminohapete ja peptiidide hulga kaudu.
Neutraalsete ja aluseliste proteaaside aktiivuse määramisel kasutatakse substraadina tavaliselt kaseiini , mis on piima põhivalk, koostiselt fosfoproteiin. Piimas esineb ta mitsellidena, kuna ta on väga hüdrofoobne. Piimast eraldatud kaseiin ei lahustu vees, kuid hästi lahustub tema Na-sool. Proteaasi aktiivsuse hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed. Selles etapis sisaldab reaktsioonisegu peamiselt pika ahelaga peptiide, märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata.
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud sadestuvad lahusest TKÄ toimel välja, samas ensüüm inaktiveerub. Sademe eemaldamisel jäävad lahusesse vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid , mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse kaudu. Aromaatse tuumaga aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270-280 nm ja seetõttu saab neid hästi detekteerida spektrofotomeetriliselt.
Proovides mõõdetakse kindlal lainepikkusega valguskiirguse neelduvust. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml. Kasutades kaliibrimissirget saadakse optiliste tiheduste kaudu türosiini kontsentratsioon kindlatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proovidel.

Töö käik
Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine
Uuritavast proteaasi preparaadist, milleks antud töös oli savinaas, valmistati ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, mille kontsentratsioon oli 1,5 mg/ml. Arvutasin savinaasi kaalutise suuruse, milleks oli 0,0075 grammi. Kaalusin analüütilistel kaaludel antud koguse ning tegin lahuse gradueeritud 5 milliliitrise mahuga katseklaasi. Esialgu lisasin väikese koguse puhverlahust ning segasin seda ~5 minutit kuni lahustumiseni, seejärel täitsin katseklaasi etteantud mahuni ning loksutasin, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks.
Ensüümreaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine

pipeteerisin suurde 50 ml mahuga katseklaasi 25 ml 2%-list kaseiini lahust ning asetasin selle korgiga kaetuna vesitermostaati 5-10 minutiks seisma
võtsin 4 kuiva normaalmõõdus katseklaasi, nummerdasin need ning igaühte lisasin 3 ml 5%-list TKÄ lahust
kui kaseiini lahus oli piisavalt soojenenud, alustasin ensüümireaktsooni, selleks pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust, loksutasin läbi, käivitasin stopperi ja asetasin selle tagasi vesitermostaati
kohe peale ensüümi lisamist võtsin puhta ja kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu ning viisin selle esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi ning loksutasin, reaktsiooniseguga katseklaasi asetasin kiiresti tagasi termostaati
5 minuti pärast võtsin sama pipetiga uuesti 3 ml reaktsioonisegu ning viisin selle teise TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi, loksutasin ja sama operatsiooni kordasin 5-minutiliste intervallidega veel 2 korda

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

proovidega katseklaasid jätsin täielikuks sademe formeerumiseks 10-15 minutiks seisma ning samal ajal panin valmis 4 kuiva ja puhast katseklaasi ja varustasin need plastlehtrite ja paberfiltritega
proovid , mille sade oli settinud, filtrisin kuivadesse katseklaasidesse
spektrofotomeetril määrasin nelja, erineval ajal reaktsioonisegudest võetud proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel 280 nm
kaliibrimisgraafikult leidsin vastavalt proovide optiliste tiheduste väärtustele neis sisalduva türosiini kontsentratsioonid

Saadud katseandmete alusel koostasin järgneva graafiku, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust
A = CTyr * 103 * V1 * V2 * 2 / t * 181 * V3 * g
CTyr - türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml)
t - hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s)
V1 - reaktsioonisegu (substraat + ensüüm) üldmaht (ml)
V2 - valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml)
2 - TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus
V3 - ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml)
g - proteaasi preparaadi kaalutis (g)
181 - türosiini molekulmass
Katseandmed :
Katseklaas nr.
Aeg t (sekundites)
D280
CTyr (mg/ml)
1
30
0,225
0,0355
2
300
0,270
0,043
3
600
0,290
0,046
4
900
0,345
0,055
CTyr = 0,055 - 0,0355 = 0,0195
t = 900 - 30 = 870
V1 = 26 ml
V2 = 5 ml
V3 = 1 ml
g = 0,0075 g
Aktiivus on seega:
A = 0,0195 * 103 * 26 * 5 * 2 / 870 * 181 * 0,0075 = 4,29 kat/g

Tulemused
Arvutuste tulemusena sain antud ensüümi proteolüütiliseks aktiivsuseks 4,29 kat/g. Kuna produktide kontsentratsiooni ja aja vahel valitseb lineaarne sõltuvus, siis katsetulemused pidid graafikul langema ühele sirgele. Minu graafikul kõik katsepunktid päris ühele sirgele ei sattunud ning asuvad sirgelt veidi kõrval. Ebatäpsus võis tingitud olla sellest, et võetud proovid ei olnud täpselt 5 minutilise vahega ning seetõttu ei saanud ka graafik lineaarne tulla.

.DOCX Laadi alla originaalfail 3 lk · .docx · 13 allalaadimist

10 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 10 punkti.

~ 3 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2014-05-12 Kuupäev, millal dokument üles laeti

13 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

mellu5 Õppematerjali autor

Biokeemia praktikumi protokoll 3.2. Arvestatud esimese korraga.

biokeemia proteaas protokoll ensüüm proteaas kontsentratsioon kaseiin reaktsioonisegu proovid türosiini kontsentratsioon ensüümid

Sarnased õppematerjalid

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool Biokeemia Laboratoorne töö 3.2 Teostaja: 2016 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid, on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke. Erinevad proteaasid omavad ka erinevat toimespetsiifikat. Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs).

Biokeemia

docx

Biokeemia proteolüütilineensüüm

PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE 1. Töö teoreetilised alused 1.1 Töö eesmärk Töö eesmärk oli määrata proteolüütilise ensüümi aktiivsus, kasutades substraadina kaseiini ja proteaasi preparaadina alkanaasi. Kasutasin meetodit, kus toimus tänu proteaasile peptiidsideme hüdrolüüsi reaktsioon. Et sadestada põhja kõrgmolekulaarsed ühendid kasutasin trikloroäädikhapet ning mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määrasin spektrofotomeetrilisel meetodil. 1.2 Teooria Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad

Biokeemia

docx

3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine - Biokeemia labori protokoll

Tallinna Tehnikaülikool 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Biokeemia labori protokoll 2011 Töö teoreetilised alused Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides. Seejuures nad produtseerivad madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase on kõikides organismides, sest nad täidavad füsioloogilisi funktsioone, sealhulgas

Biokeemia

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL Keemia instituut Bioorgaanilise keemia õppetool Biokeemia praktikumi laboratoorne töö 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Üliõpilane: Liis Hendrikson Matrikli nr: 104191 Õpperühm: KATB 41 Juhendaja: Tiina Randla 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Töö teoreetilised alused: Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (ka proteinaasid või peptidaasid) on ensüümis, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises (nt vere hüübimise kaskaad).

Biokeemia

pdf

3.2 Proteaas

Tallinna Tehnikaülikool YKL0060 Biokeemia Töö nr 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Yasb 21 Juhendaja Tiina Randla 20.04.2012 Teooria Proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, sest nende ülesanded ulatuvad alates toiduvalkude seedimisest kuni väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadideni nt vere hüübimise kaskaad.

rekursiooni- ja keerukusteooria

docx

3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (EC 3.4.4) on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassida peptiide ja vabu aminohappeid. Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid

Biokeemia

doc

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (alkalaas)

Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid: · Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2 Pro) · Kümotrüpsiin (R1 = Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2 Pro) · Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 Pro) Samas aga paljud bakteriaalsed proteaasid, nagu subtilisiin, savinaas, alkalaas jt omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud proteaasid kuuluvad endopeptidaaside rühma. Eksopeptidaaside esindajateks on karboksüpeptidaasid (R2 = C-terminaalne aminohape) ja aminopeptidaasid (R1 = N-terminaalne aminohape), mis lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5),

Biokeemia

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia instituut BIOKATALÜÜS 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Juhendaja: Tiina Randla Töö teoreetilised alused Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidide, produtseerides madala molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaasi leidub kõigis organismides, kuna nad osalevad erinevate funktsioonide täitmises. Näiteks toiduvalkude seedimises ja kõrgreguleeritud

Biokeemia

Rohkem sarnaseid