Biokeemia labori protokoll 1.3 - Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega (0)

Tallinna Tehnikaülikool
1. Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega

Biokeemia labori protokoll

2011

1.3 Lipiidide reaktsioonid

Töö teoreetilised alused

Lipiidid on heterogeensed ühendid, millele on omane estersideme(te) esinemine. Lipiidid ei lahustu enamasti vees ja vesilahustes, mis on tingitud hüdrofoobsete aatomirühmadest ja pikkadest süsivesinikradikaalidest. Lipiidid lahustuvad apolaarsetes orgaanilistes solventides ja vähesel määral ka polaarsetes solventides.
Lipiidide esinevad rakumembraani koostises, ning neil on energeetiline-, kaitse-, ja regulatoorne funktsioon.
Vastavalt molekui ehitusele ja omadustele klassifitseeritakse neid järgnevalt: rasvhapped, rasvad , glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid , vahad, steroidid ja terpenoidid.
Seebistumisvõimest lähtudes jagatakse lipiide seebistuvates ja mitteseebistuvateks.
Struktuurist lähtuv jaotus on järgmine: lihtlipiidid, liitlipiidid ja tsüklilised lipiidid.
Rasvad on keemiliselt ehituselt rasvhapete glütserüülestrid. Hüdrofoobsed rasvamolekulid on sobilikud toiduenergia säilitamiseks, olles loomades kogunenud rasvadepoodesse ja taimedes seemnetesse. Naturaalsetes rasvades esineb palju nii küllastunud kui ka küllastumata rasvhappeid . Inimesele on nendest kõige tähtsamad linool- ja α- linoleenhape , sest inimorganism ei suuda neid ise sünteesida. Looduslikel küllastumata rasvhapetel esinevad kaksiksidemed enamasti cis-konfiguratsioonis ja ahel on seetõttu väändunud. Trans-konfiguratsioonid olevad küllastumata rasvhapete ahelad on kujult sik-sakilised ja käituvad biomembraanis nagu küllastunud rasvhapped. Organismis on nad raskesti metaboliseeritavad.
Glütserofosfolipiidid on kõikide rakumembraanide põhiline koostisosa . Nad on amfifiilsed molekulid, sest sisaldavad lisaks kahele rasvhappe radikaalile ka fosforhappe jääki. Selle kaudu seonduvad aminoalkoholid ja moodustub polaarne tsenter. Glütserofosfolipiidid moodustavad vesikeskkonnas membraane, vesiikuleid ja liposoome.
Steroolide ehituslikuks aluseks on steraanituum, mis asendis C-3 on hüdroksüleeritud. Steroolid moodustavad rasvhapete estreid ehk steriide. Kõige levinum loomne sterool on kolesterool . Kolesterool esineb peaaegu kõikide loomsete rakumembraanide koostises ja tagab membraanide läbitavuse ning liikuvuse . Kolesteroolist toodetakse ka steroidhormoone ja D-vitamiini.
Fütosteroolid on steroolid, mis esinevad taimerakkude membraanides. Kolesteroolist ja üksteisest erinevad nad C-17 asendusrhma ehituse poolest. Fütosteroolide sisaldus on eriti kõrge mõnedes taimeõlides ja nad takistavad kolesterooli imendumist.

1.3.1 Rasvapleki proov

Kõik lipiidid lahustuvad orgaanilistes lahustites . Kui lipiidi sisaldava lahuse tilk kanda paberile, siis lahusti aurustumisel moodustub moodustub paberile rasvaplekk , mille tõttu paberi läbipaistvus suureneb. Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust alast paberil heledam ja pimeda ala poole vaadates tumedam .
Katse käik: Panin ühte katseklaasi u 1g rasvapleki proovi ainet I ja teise katseklaasi sama palju rasvapleki proovi ainet II. Lisasin mõlemasse katseklaasi u 0,5 ml atsetooni . Loksutasin ja lasin settida. Sademe kohale tekkis selge lahuse kiht. Võtsin mõlemast katseklaasist pipetiga tilgakese lahust ja kandsin erinevatele filterpaberi tükikestele. Lasin kuivada ning vaatlesin siis pabereid vastu valgust ning ka tumeda ala poole.
Tulemus: Sellel paber, kuhu oli tilgutatud lahust, mis oli võetud esimesest katseklaasist (rasvapleki proov I), oli vastu valgust vaadeldes selgelt näha heledamat suurema läbipaistvusega ala ning vastu tumedamat pinda vaadates tumenenud ala. Teisel filterpaberil rasvaplekile iseloomulikke tunnuseid ei esinenud.
Järeldus: Esimene lahus, mis oli valmistatud rasvapleki proov I ainest, sisaldas lipiide. Rasvapleki proov 2 lipiide ei sisaldanud.

1.3.2 Emulsioonitest

Emulsioon on kahe-või enamafaasiline süsteem, mida tuntakse ka kolloidina. Emulsioon koosneb kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena teises vedelikus . Emulsioonid hajutavad läbivat valgust ja neid saab kindlaks teha hägu tekkimisega.
Rasvade kui rasvhapete glütserüülestrite tunnuseks on hüdrofoobsus ja lahustumatus vees ja vesilahustes. Orgaanilistes solventides aga nad lahustuvad. Kui orgaanilises solvendis lahustatud rasvalahus viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja seda segada/loksutada, moodustub õli-vees tüüpi emulsioon.
Katse käik: Valasin ühte katseklaasi emulsioonitesti lahust I ja teise katseklaasi emulsioonitesti lahust II. Lisasin kummalegi u 2 ml etanooli ning lahjendasin destilleeritud veega. Loksutasin katseklaase.
Tulemus: Esimeses katseklaasis, mis sisaldas emusioonitesti lahust I, tekkis hägu. Teises katseklaasis, kus oli emulsioonitesti lahus II, muutusi ei toimunud.
Järeldus: Hägu tekkimine esimes katseklaasis annab tunnistust emulsiooni tekkest ja võib öelda, et emulsioonitesti lahus I sisaldas lipiide. Emulsioonitesti lahus II lipiide ei sisaldanud, kuna emulsiooni ei tekkinud.

1.3.3 Akroleiiniproov

Kui glütserooli kuumutada vett siduvate ainete juuresolekul, siis tekib teravalõhnaline aldehüüd propenaal ehk akroleiin . Sama reaktsiooni annavad rasvad ja glütserofosfolipiidid, aga ei anna glütserooli mittesiduvad lipiidid.
Katse käik: Kandsin kahte katseklaasi u 1g NaHSO4 ja lisasin ühte katseklaasi paar tilka akroleiiniproov I lainet ning teise katseklaasi sama palju akroleiiniproov II ainet. Kuumutasin katseklaase tõmbekapis gaasipõleti kohal kuni sool sulas ja üks proovidest tumenes. Nuusutasin ettevaatlikult proove.
Tulemus: Esimene proov tumenes pisut, teine üldse mitte. Esimesel proovil oli ka spetsiifiline lõhn, teisel proovil ma seda ei täheldanud.
Järeldus: Proovi tumenemise ja iseloomuliku lõhna tekke järgi võin öelda, et esimeses proovis tekkis akroleiin, mis annab tunnistust sellest, et akroleiinitesti proov I sisaldas lipiidi, mille koostisesse kuulub glütserool. Teine proov glütserooli sisaldavat lipiidi ei sisaldanud.

1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides

Küllastumata rasvhapete kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse reaktsiooni halogeniididega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga pruun värvus võib lahjeneda, kuid ei kao, samas aga küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus liitumisreaktsiooni tõttu värvituks.
Katse käik: Valasin ühte katseklaasi 2 ml 2% searasva lahust (loomne rasv ), teise katseklaasi sama palju 2% oliivõli lahust (taimne rasv) ja kolmandasse võrdse mahu 2% palmithappe lahust ( rasvhape ). Lisasin kõikidesse katseklaasidesse 10 tilka broomi lahust ning loksutasin katseklaase.
Tulemus: Palmithapet sisaldavava lahusega ei toimunud broomi lahuse lisamiseks mingeid muutuseid, säilis broomile iseloomulik pruun värvus. Lahus, mis sisaldas oliivõli, muutus broomi lahuse lisamisel intensiivseks kollakas-oranžiks. Searasva lahus muutus hele-helekollaseks, peaaegu et värvusetuks.
Järeldus: Kuna palmithappe lahusega muutusi ei toimunud, võib järeldada, et palmithape (puhas rasvhape) sisaldab küllastunud rasvhappeid (52%) ja seega ei sisalda kordseid sidemeid . Oliivõli lahus muutus palju heledamaks, kuid pruun värvus täielikult ei kadunud, seega sisaldab ka oliivõli küllastunud rasvhappeid (Kirjanduse andmete põhjal tegelikult ainult 14%.) ja kordseid sidemeid, kuid vähem kui palmithape. Kirjanduse põhjal selgub, et tegelikult peaks oliivõli sisaldama just rohkem küllastumata rasvhappeid (73% monoküllastumata ja 11% polüküllastumata rasvhappeid).
Kuna searasva lahuse värvus peaaegu täielikult kadus , siis võib järeldada, et searasv sisaldab palju küllastumata rasvhappeid (47% monoküllastumata + 2% polüküllastumata rasvhappeid) ja seega vähe kordseid sidemeid.

1.3.5. Liebermann-Burchard’i kolesterooli määramise test

Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga väävelhappe keskkonnas tekib tume sinas-rohelise värvusega reaktsioonisegu. Tegemist on mitmeastmelise reaktsiooniga ja lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üle punase ja sinise vaheühendi. Tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu.
Katse käik: Valasin kolme katseklaasi 2 ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis. Esimesse katseklaasi valasin kolesteroolilahust, teise katseklaasi rapsiõli lahust (taimne rasv) ja kolmandasse searasva lahust (loomne rasv). Igasse katseklaasi tilgutasin u 7 tilka äädikhappe anhüdriidi ja u 5 tilka kontsentreeritud väävelhapet. Loksutasin segusid.
Tulemus: Kolesteroolilahus säilitas oma tumesinise värvuse ja muutusi ei toimunud. Rapsiõli lahus muutus rohekaspruunikaks ja tekkis sade. Searasva lahus muutus heleroheliseks/helesiniseks ja pisut häguseks.
Järeldused: Kolesteroolilahus sisaldas kõige rohkem kolesterooli, sest tumesinine värvus säilis reaktsiooni toimumise käigus. Rapsiõli lahus sisaldas kolesterooli vähem kui kolesteroolilahus ning searasva lahus sisaldas kolesterooli kõige vähem.