Töö käik: · valan katseklaasi 1ml munavalgu lahust · lisan 1ml 10%-list NaOH lahust, et reaktsioonikeskkond oleks aluseline · mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust ja loksutan - tekib lilla värvus Lahus värvub lillaks, sest tekib biureetkompleks. 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) See on reaktsioon aromaatseid tuumasid sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu kindlaktegemiseks valgus. Konts lämmastikhappe lisamisel denatureerub valk pöördumatult ja sadestub. Kuumutamisel toimub aga aromaatsete tuumade nitreerimine ning moodustunud nitrofenooli tüüpi ühend on kollase värvusega indikeerides hape/alus olukorda. Leeliselises lahuses omandab oranzi värvuse. Töö käik: · Valan katseklaasi 1ml munavalgu lahust · Lisan 5-6 tilka konts HNO3 lahust · Loksutan tekib valge sültjas sade (denatureerunud valk)
Cu -laktoglobuliinis, laktoferriinis, rasvagloobuli membraani valkude koostises Mn rasvagloobuli membraanivalkudes Co Vitamiin B12 koostises 6. Vitamiinid: A-retinool, D-kaltsiferool, E-tokoferool, B1-tiamiin, B2-riboflaviin, B5- pantoteenhape, B6-püridoksiin, B12-kobalamiin, H-biotiin, PP-nikotiinhape, C-askorbiinhape 7. Ensüümid: 1. Oksüdoreduktaasid: Laktoperoksüdaas denatureerub temperatuuril 80°C Katalaas denatureerub temperatuuril 75°C Reduktaas piimabakterite sünteesitud 2. Hüdrolaasid: Aluseline fosfataas inaktiveerub temperatuuril 71,7°C 15 sek jooksul Lipaas denatureerub temperatuuril 80°C Proteaas Lüsotsüüm 3. Laktoferriin Mikroobide kasvuinhibiitorid piimas: I. Laktoperoksüdaassüsteem (LPS) 1. Laktoperoksüdaas - glükoproteiin 2. Tiotsüanaat SCN- (ah- tiosulfaat- tiotsüanaat) 3
DNA-lõigud jooksevad + pooluse poole, seda kiiremini, mida lühemad nad on. PCR metoodika: Ependorfis segatakse kokku: nukleotiidid (kõiki nelja erinevat) DNA-polümeraas oma DNA lahus praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA- piirkonna mõlema “otsaga”. Ependorf pannakse 3 tunniks PCR-masinasse. PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuride vaheldumisele: 92oC - DNA denatureerub 58C - praimerid liituvad 72oC - DNA-polümeraas käivitab replikatsiooni. See tsükkel kordub masinas 34 korda. Fragment, mida tahetakse paljundada PCR Kuumutamisel 90-ni DNA denatureerub Praimerid ühinevad madalamal temp-l
Nukleiinhapetes on organismi elutegevuse juhised Rakkudes esineb kaks nukeiinhapet: DNA ehk deoksüribonukleiinhape ja RNA ehk ribonukleiinhape. Nukleiinhapped on nukleotiididest koosnevad suured biomolekulid, mis sisaldavad raku tegevusjuhiseid, vesinikside DNA on päriliku info säilitaja. DNA molekul on kaheaasaline spiraal, mis on kokku pandud nukleotiididest. DNA nukleotiidid koosnevad 3 komponendist: Viiesüsikulisest suhkrust desoküriboos Lämmastikalustest : o A adeniin o G guaniin o T tümiin o C - tsütosiin Fosfaatrühmast Erinevate lämmastikaluste järjestus DNA ahelas kannabki pärilikku informatsiooni. RNA ülesanne on päriliku info kasutamine. RNA nukleotiidides on kolm osa: Suhkur riboos Lämmastikaklused: o A adeniin o G guaniin o C tsütosiin o U ura...
Kahevalentne katioon, tavaliselt Mg++ on ensüümi tööks absoluutselt vajalik 9. Miks lahus 1? 2? 3? Lahus 1 sisaldab glükoosi, EDTA ja Tris-HCl. EDTA seob kahevalentseid metallioone, mis on vajalikud nt DNaasi tööks + EDTA aitab stabiliseerida DNA fosfaat selgrooga . Suspendeeritakse puhvris, sest vees võib DNA laguneda. Lahus 2 sisaldab SDS ja NaOH. Aluseline töötlus, mille käigus detergent SDS lõhub rakumembraani ja alus saab seonduda plasmiidse DNAga, mis seejärel denatureerub. Aluselises keskkonnas rakud lüüsuvad ja DNA denatureerub. Segada õrnalt. Lahus 3 sisaldab KOAc (kaaliumoksaalatsetaat). See neutraliseerib lahust ja lubab plasmiidse DNA renatureerimise ja KOAc aitab sadestada detergendi (SDS). Kuna viiruse genoom on väiksem, siis renatureerub ta kiiremini kui bakteri 4Mb suurune kromosoom. Kromosoom ei jõua kaheahelaliseks minna. 10. Miks RNA töötlus? RNaasi töötlus aitab veelgi puhtamaks saada puhastatavat DNA lahust. RNaas lagundab RNA rakkudes. 11
elektrolüüsi vanni. DNA-lõigud jooksevad + pooluse poole, seda kiiremini, mida lühemad nad on. PCR metoodika: Ependorfis segatakse kokku: nukleotiidid (kõiki nelja erinevat) DNA-polümeraas oma DNA lahus praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA-piirkonna mõlema "otsaga". Ependorf pannakse 3 tunniks PCR-masinasse. PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuride vaheldumisele: 92oC - DNA denatureerub 58°C - praimerid liituvad 72oC - DNA-polümeraas käivitab replikatsiooni. See tsükkel kordub masinas 34 korda. Fragment, mida tahetakse paljundada PCR Kuumutamisel 90-ni DNA denatureerub Praimerid ühinevad madalamal temp-l
Lisasin sama palju 10%-list NaOH lahust ning paar tilka 1%-list CuSO4 lahust. Loksutasin ning soojendasin katseklaasi. Tulemus: Lahus värvus violetseks. Järeldused: Lahuses esinesid valgumolekulid (ühend, mis sisaldab kaht või enamat peptiidsidet), sest moodustub violetne biureetkompleks. 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Mulderi reaktsiooniga saab tõestada aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete olemasolu valgus. Kontsentreeritud HNO3 lisamisel valk denatureerub pöördumatult ja sadestub lahusest välja. Soojendamisel aromaatsed tuumad nitreeruvad. Moodustub kollane nitrofenooli ühend, mis leeliselises keskkonnas värvub oranziks. Töö käik: 1 ml munavalgu lahusele lisasin 6 tilka konts. HNO3, loksutasin (tekkis valge sade)ning seejärel soojendasin kuni kollase sademe tekkimiseni. Jahutasin segu, siis lisasin NH4OH lahust ja loksutasin. Tulemus: Lämmastikhappe lisamisel tekkis valge sade, soojendamisel helekollane sade ning
Elektronfotod: Ebola viirus; Herpes viirus VIIRUSTE EHITUS genoom (DNA kapsiid või RNA) (valguline kate) ümbris valgud VIIRUSTE EHITUS Genoom nukleiinhapped säilitavad pärilikku infot. Kapsiid kaitseb genoomi keskkonnamõjutuste eest ja aitab viiruse genoomi peremeesrakku. Miks peab puuvilju pesema kuuma veega? Kapsiid denatureerub tavaliselt 60 75° C juures. Ümbris tavaliselt peremeesraku membraanist. BAKTERIOFAAGI EHITUS Viirus, mille peremeesrakuks on bakter. GEENIDE ÜLESANDED Iga viiruse genoomis on kolme tüüpi geene. Replikatsioonigeenid - Kindlustavad viiruse genoomi paljunemise Regulaatorgeenid - Mõjutavad peremeesraku ainevahetust (endale soodsamaks) Struktuurgeenid - Kindlustavad viirusvalkude sünteesi VIIRUSTE KLASSIFIKATSIOON
Kuju: pulkjas, kerajas, spiraalne, ... parvoviirus adenoviirus papilloomviirus tubaka mosaiikviirus herpesviirus bakteriofaag Viirused... Ehitus: valguline kate e. kapsiid Viirusosake ehk nukleiinhape (DNA või RNA) virioon ümbris peremeesraku membraanist Nukleiinhape on 1- või 2-ahelaline, koosneb 1-st või mitmest molekulist Kapsiid denatureerub 60 75° C juures Viirused... RNA-viirus Ehitus: Ümbris Genoomi kaitse Aitavad seonduda peremeesraku Kapsiid membraaniga Genoom antiretseptorid Raku retseptorid Viirused... bakteriofaag Ehitus: DNA või RNA (3 ... X00 geeni)
Elektronfotod: Ebola viirus; Herpes viirus VIIRUSTE EHITUS genoom (DNA kapsiid või RNA) (valguline kate) ümbris valgud VIIRUSTE EHITUS Genoom nukleiinhapped säilitavad pärilikku infot. Kapsiid kaitseb genoomi keskkonnamõjutuste eest ja aitab viiruse genoomi peremeesrakku. Miks peab puuvilju pesema kuuma veega? Kapsiid denatureerub tavaliselt 60 75° C juures. Ümbris tavaliselt peremeesraku membraanist. BAKTERIOFAAGI EHITUS Viirus, mille peremeesrakuks on bakter. GEENIDE ÜLESANDED Iga viiruse genoomis on kolme tüüpi geene. Replikatsioonigeenid - Kindlustavad viiruse genoomi paljunemise Regulaatorgeenid - Mõjutavad peremeesraku ainevahetust (endale soodsamaks) Struktuurgeenid - Kindlustavad viirusvalkude sünteesi VIIRUSTE KLASSIFIKATSIOON
tihedalt seotud immuunsusega; veresoonte purunemisel tekkinud hüübed ("kärnad") moodustavad esmase kaitse vigastatud kohale ja soodustavad paranemist jne. Punalibled e. erütrotsüüdid ca 95 % kõigist vererakkudest (4,2 6,2 miljonit/cmm), ilma tuumata, ketta kujulised, sisaldavad hemoglobiini , mis seob hapnikku (siis helepunane!) ja osalt ka süsihappegaasi (siis tumepunane!). Erütrotsüütide purunemisel (hemolüüsil) vabanenud hemoglobiin denatureerub ei seo enam hapnikku! Valgelibled e. Leukotsüüdid eristatakse 5 põhitüüpi, palju alatüüpe, kõik mingil moel seotud organismi kaitsereaktsioonidega. Leukotsüütide põhitüübid: 1) Neutrofiilsed granulotsüüdid fagotsütoos. 2) Basofiilsed granulotsüüdid eritavad histamiini põletik!, ja hepariini hüübimise takistamine. 3) Eosinofiilsed granulotsüüdid põletiku takistamine. 4) Lümfotsüüdid võitlus infektsioonidega (antikehad, "mälu" jne.) 5)
koguhulgast tema arvel kuni 5% 2. tRNA- molekulide ülesanne aminohapete transport valgu sünteesiks, RNAde koguhulgast 15% 3. rRNA- ülesanne kuulumine koos valkudega ribosoomi koostisse, millel valgu süntees toimub. Ligi 80% Kaval: Võrdle DNAd ja RNAd kahest aspektist 1. erinevuste paaride teadmine (tunnuste võrdlus: DNAl pentoosiks desoksüriboos, RNAl riboos; nukleotiidide hulk DNAl suurem, RNAl väiksem; denaturatsioon teisasel struktuuril DNA denatureerub aeglasemalt, RNA kiiremini) 2. võrrelge, leidke ühiseid tunnuseid: mõlemad koosnevad nukleotiidijääkidest, mõlemas esineb fosfodiestersidemed, mõlemaid leidub kromosoomides, mõlemad denatureeruvad jne.
Töö käik Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust. Lisatakse 1 ml 10% NaOH lahust ja mõni tilk 1% CuSO4 lahust. Loksutatakse. Reaktsioonisegu muutub lillakaks, mille põhjustavad biureetkompleksid. Järeldus Lillakas (violetne) värvus kinnitab pika peptiidahela ehk valgu olemasolu lahuses. 1.1.2. Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Ksantoproteiinreaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus. Konts. lämmastikhappe lisamisel denatureerub valk pöördumatult ja sadestub. Soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine tekib intensiivse kollase värvusega lahus, mis leeliselises keskkonnas omandab oranzi värvuse. Töö käik Katseklaasi valatakse 1ml munavalgu lahust ja lisatakse 5-6 tilka kontsentreeritud HNO3. Segu loksutatakse ja soojendatakse kuni kollase sademe tekkeni. Segu jahutatakse, lisatakse NH3H2O lahust ammoniaagi lõhna ilmumiseni ja loksutatakse. Kollane sade muutub oranziks. Järeldus
moodustavad valgumolekulid Cu2+ ioonidega olenevalt ahela pikkusest kas sinakasvioletse või roosaka biureetkompleksi. Töö käik: valasin katseklaasi 1ml munavalgu lahust, lisasin 1ml 10% NaOH ning paar tilka CuSO4 lahust, loksutasin. Värvus muutus lillakaks, sest vaseioonid moodustasid valgumolekulidega biureetkompleksi. 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus. Konts. HNO3 lisamisel denatureerub valk lõplikult ja sadestub. Lahuse kuumutamisel toimub aromaatse tuuma nitreerumine ning lahus muutub kollaseks. Moodustunud ühend käitub indikaatorina, moodustades leeliselises keskkonnas oranzi värvuse. Töö käik: valasin katseklaasi 1ml munavalgu lahust, lisasin 5 tilka konts. HNO 3. Loksutasin ning hakkasin kuumutama kuni sade muutus kollakaks. Hiljem jahutasin ning lisasin NH 4OH lahust, loksutasin. Lahus muutus oranziks, mis tähendab, et katse õnnestus, lahus muutus
1%-list CuSO4 lahust. Loksutasin katseklaasi sisu. Reaktsioonisegu muutus lillaks. Järeldus: lahuses olid peptiidsidemed, kuna need moodustasid aluselises keskkonnas Cu 2+-ioonidega violetse biureetkompleksi. 2. Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Mulderi reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) sisaldumist valgus. Konsentreeritud HNO3 lisamisel valk denatureerub pöördumatult ja seadestub. Katseklaasi soojendamisel aromaatsed tuumad nitreeruvad ja moodustub intensiivse kollase värvusega ühend, mis omandab leeliselises keskkonnas oranzi värvuse. Töö käik: valasin katseklaasin 1 ml munavalgulahust, lisasin 5 tilka konsentreeritud HNO 3-e. Loksutasin reaktsioonisegu ja soojendasin, kuni tekkinuda valge sade värvus kollaseks. Jahutasin segu, lisasin NH4OH lahust kuni ammoniaagi lõhna ilmumiseni ja loksutasin katseklaasi. Lahus muutus
10.Kirjutage mingi pürimidiinnukleotiidi struktuurvalem (lämmastikalus vabalt valida). Andke selle nukleotiidi nimetus, iseloomustage komponente ning neid ühendavaid keemilisi sidemeid. 11.Arvutage A, C, G ja T jääkide arv sellise organismi rakkude DNA’s, mille genoomi usurus on 25 000 kb (1kb=1000bp), kui on teada, et G jääkide sisaldus selles on 29%. 12.Mida tähendab DNA denaturatsioon? Milliste faktorite toimel DNA denatureerub? 13.Loetlege RNA põhitüübid, iseloomustage nende struktuure ja bioloogilist rolli. 14.Selgitage, a)milline on vitamiin A nimetus, b)mis on vitamiin A lähteühendiks/lähteühenditeks, c) milline on mitamiin A füsioloogiline toime, d) millistet toiduaneted vitamiin A sisaldub, millistes tema lähteühendid? 15.Selgitage, milline protsess kannab glükolüüsi nimetust ja iseloomustage seda järgmistest aspektidest:
· loksutasin hoolikalt Tulemused ja järeldused: Lahus muutus lillaks või violetseks, millest võib järeldada, et lahuses oli aluseline keskkond ning tekkis biureedikompleks. See omakorda tõestab 2 või enama peptiidsideme olemasolu lahuses. 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Ksantoproteiinreaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus. Kontsentreeritud lämmastikhappe lisamisel denatureerub valk pöördumatult ja sadestub. Katseklaasi sisu soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine. Moodustunud ühend on intensiivse kollase tooniga ja omandab leeliselises keskkonnas oranzi värvuse. Töö käik: · valasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust · lisasin 5 tilka kontsentreeritud HNO3 · loksutasin · soojendasin kuni valge sade muutus kollaseks · jahutasin · lisasin NH4OH lahust kuni ammoniaagi lõhna tekkimiseni
termiline katseklaas: 2 ml kuumutamisel häguseks, kuna valgud denatureerimi munavalgu lahust, denatureerivad kõrgel temperatuuril, ne ja 1 ml denatureerumisele kaasneb tavaliselt lahustuvuse kontsentreeritud ka valgu väljasadestumine. Munavalgu sõltuvus pH-st äädikhapet. Teine lahuses koos äädikhappega ei katseklaas: 2 ml toimunud muutusi.kuumutamisel valk munavalgu lahust denatureerub, happelise pH juures ei sadestu välja, sest lahustub vees. 8) Valkude 2 ml munavalgu Lisasin orgaanilist solventi munavalgu sadestamine lahust, etanooli, lahusele ning tekkis sade. Etanool orgaaniliste kuni sademe põhjustab valkude dehüdratiseerumist lahustitega tekkimiseni, vesi, ja sadestab neid lahustest välja. Vee kuni sademe lisamisel sade kaob, kuna sadesti
Etaanhapet 3.Mõlemaid kuumutasin keeval vesivannil Lahuses kus oli ainult munavalk tekkis sade, kuna etaanhappe lisamine teisesse katseklaasi muutus keskkona pH väärtuse => erineb ta tunduvalt valgu pI väärtusest =>valk ei sadestu. VALKUDE SADESTAMINE ORGAANILISTE LAHUSTITEGA Veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides (esile aminohapete apolaarsete radikaalide) pöördumise molekulide välispinnale. Valgu dehüdratiseerumine valk sadestub (denatureerub pöörduvalt) 1.2ml munavalgu lahust 2.Tilgakaupa ja loksutades lisasin etanooli, tekkis sade 3.Lahjendasin veega , sade lahustus Etanooli lisamisega valk dehüdratiseerus ja sadestus => valk denatureerus pöörduvalt, kuna vee lisamisega sade kaos. SÜSIVESIKUD - polümeerid, monomeerid monosahhariidid (monoosid = lihtsuhkrud), seotud O-glükosiidsidemega. On olemas mono-, oligo-, polüsahhariidid. Monosahhariidid erinevad stereostruktuurilt erinevad omadused
DNA-lõigud jooksevad + pooluse poole, seda kiiremini, mida lühemad nad on. PCR metoodika: Ependorfis segatakse kokku: nukleotiidid (kõiki nelja erinevat) DNA-polümeraas oma DNA lahus praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA- piirkonna mõlema "otsaga". Ependorf pannakse 3 tunniks PCRmasinasse. PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuride vaheldumisele: 92o C DNA denatureerub 58° C praimerid liituvad 72o C DNApolümeraas käivitab replikatsiooni. See tsükkel kordub masinas 34 korda.
kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Töö käik: 1 ml munavalgu lahusele lisati 1 ml 10% NaOH lahust ja mõni tilk 1% CuSO4 lahust. Tulemus: CuSO4 lisamisel muutus lahus lillakaks Järeldus: Munavalgu lahuses esinesid peptiidsidemed 1.1.2 Ksantoproteiinreaktioon (Mulderi reaktsioon) Reaktsioon näitab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Phe, Trp, Tyr) esinemist valgus. Lämmastikhappe mõjul valk denatureerub. Soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine, tekkinud ühend on kollaka värvusega, mis leeliselises keskkonnas omandab oranzi värvuse. OH - O O OH O 2N NO 2 O 2N N 2HNO3 OH- O
sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses Töö käik Võtan katseklaasi 1 ml munavalge lahust, lisan 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõne tilga 1%- list CuSO4 lahust. Loksutan hoolikalt. Lahus muutub tumesinisest lillaks. Katse näitas, et tegemist on pika valgumolekuliga. Ksantoproteiinreaktsioon Ksantoproteiinreaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüpofaan ja fenüülalaniin) olemasolu valgus. Kontsentreeritud HNO 3 lisamisel valk denatureerub ja sadeneb. Katseklaasi sisu soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine. Moodustunud ühend on kollase värvusega ja käitub alus-happe indikaatorina, olles leeliselises keskkonnas oranz. Töö käik Valan katseklaasi 1 ml munavalgu lahust ja lisan 5-6 tilka kontsentreeritud HNO 3. Loksutan ja soojendan reaktsioonisegu kuni tekkinud valge sade värvub kollaseks. Jahutan segu ning lisan NH4OH lahust kuni ammoniaagi lõhna ilmumiseni, loksutan hoolikalt. Lahus oleks pidanud
violetse kompleksi. Töö käik Valan katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, lisan 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust. Loksutan katseklaasi hoolikalt. Järeldus Lahus värvub violetseks, seega sisaldab munavalgu lahus vähemalt kahte peptiidsidet. 1.1.2.Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Ksantoproteiinreaktsioon tõestab aromaatse tuuma olemasolu. Lahuse nitreerimise tagajärjel denatureerub valk pöördumatult ja sadestub. Moodustunud nitrofenooli tüüpi ühend annab kollase värvuse ja käitub hape/alus indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas oranzi värvuse. Töö käik Valan katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, lisan 5-6 tilka kontsentreeritud HNO 3, loksutan ja soojendan, kuni sade värvub kollaseks. Seejärel jahutan segu ja lisan NH4OH lahust ja loksutan lahust. Järeldus Lahus värvus küll kollaseks, mis tõestab aromaatset tuuma, kuid
Lisada 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust. Tulemus: Esialgu oli reaktsioonisegu värvus sinine, seejärel muutus lillaks. Reaktsioon tõestas peptiidsidemete olemasolu munavalgu lahuses. Tekkinud biureetkompleksi struktuur: 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Reaktsioon tõestab aromaatse tuuma sisaldavate aminohapete(trüptofaan; türosiin; fenüülanaliin) olemasolu valgus. Lämmastikhappe lisamisel valk denatureerub. Katseklaasi sisu soojendades toimub aromaatsete tuumade nitreerumine (kollase värvusega), omandab leelisesises keskkonnas oranzi värvuse. Töö käik:1 ml munavalgu lahusele lisada 6 tilka kontsentreeritud HNO3. Loksutada, soojendada, kuni sade on kollane. Jahutada. Lisada NH4OH lahust kuni ilmub ammoniaagi lõhn. Tulemus: Valge sade muutus soojendades kollaseks. NH4OH lisades muutus sade oranzikaks. Katse tõestas, et munavalk sisaldab aromaatset tuuma sisaldavaid aminohappeid. 1.1
katseklaasis oleva munavalgu lahuse pH-d muutis äädikhape, mille tõttu erines keskkonna pH väärtus tunduvalt valgu pI väärtusest. 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega Orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. Töö käik: Katseklaasi valatakse 2 ml munavalgu lahust. Tilgakaupa lisatakse orgaanilist solventi ja loksutatakse pidevalt sademe tekkimiseni. Seejärel lahjendatakse katseklaasi sisu veega. Järeldus: Sade jäi alles. Järelikult oli reaktsioon pöördumatu. Selle põhjuseks võis olla solvendi kõrge lokaalne konsentratsioon. 1.2 SÜSIVESIKUTE REAKTSIOONID
9. Liha- ja kalavalgud. Albumiinid, Aktiin on olulise tähtsusega kõigis eukarüootsetes rakkudes. Müosiin Kollageen on sidekoe valk, mis määrab ära liha pehmenemise. Selleks, et liha pehmeneks, peab ligi 40% kollageeni struktuurist lagunema, mille tulemusel tekib kliadiin, mis on vees lahustuv ning on liha pehmenemise näitajaks. Sealihas on rohkem sidekudet rohkem kui kalas. Selle pärast valmib kala kiiremine kui näiteks sealiha. Kalaliha denatureerub madalamal temperatuuril. Müoglobiin on see, mis määrab ära liha värvuse. Oksüdeerumisel näiteks hallikaspruun värv. Hapniku siduja lihastes Elastiin on kummilaadne, elastne, kiulise ehitusega, mis ei anna meile tarrendstruktuuri ning on küllalt raskesti seeditav. 10. Teraviljavalgud. Prolamiinid, gluteiin Nisuvalgud - nisus võib eristada gluteeni ja mitte-gluteenseid valke. Nende omadused on erinevad. Gluteen annab nisutaignas karkassi. Gluteen tagab gaasihoidmisvõime, sisu
mille keskkond on neutraalne (pH=7), sadestus. Siinkohal võib öelda, et happelisel lahusel erines pH tunduvalt isoelektrilisest täpist(pl), mistõttu väljasadestumist ei toimunud. Katseklaasis, kuhu etaanhapet ei lisanud, toimus valgu pöördumatu denaturatsioon ja munavalk sadestus välja. 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega Veega segunevad orgaanilised solvendid põhjustavad valkude dehüdratiseerumist, mis omakorda tekitab valgu sadestusmise. Sadesti vaikselt lisamisel denatureerub valk pöörduvalt. Sadesti liigsel lisamisel või suurel kiirusel toimub pöördumatu denaturatsioon. Töö käik: Katseklaasi valatakse 2ml munavalgu lahust. Tilgkaupa ja loksutades lisatakse orgaanilist solventi kuni sademe tekkimiseni (hägune sade). Seejärel lahjendatakse katseklaasi sisu veega. Sade lahustub. Järeldus: Sade lahustus täielikult, seega on tegu pöörduva denaturatsiooniga, kus vee lisamisel sade uuesti lahustus. Süsivesikute reaktsioonid
1ml munavalgu lahust, lisasin 1 ml 10%-list NaOH lahust ja 2 tilka 1%- list CuSO4 lahust. Loksutasin katseklaasi sisu. Värvuse muutus toimus suhteliselt kiiresti ning vesivannil soojendamist ei vajanud. Järeldus: Sellest katsest saab järeldada, et munavalgu lahus on valgu lahus, ehk sisaldab kaht või enamat peptiidsidet. 1.1.2 Ksantoproteiinireaktsioon (Mulderi reaktsioon) Selle katsega saab määrata aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete olemasolu valgus (Tyr, Phe, Trp). Valk denatureerub pöördumatult ja sadestub kui lisada sellele konts. Lämmastikhapet. Katseklaasi soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine. Tekkinud nitrofenooli ühend on intensiivse kollase värvusega, käitudes hape/alus indikaatorina. Töö käik: Valasin katseklaasi u. 1ml munavalgu lahust ja lisasin 5 tilka konts. HNO3. Loksutasin segu ja soojendasin vesivannis. Kuumutamisel muutus eelnevalt tekkinud sade helekollaseks.
Mida suurem ES energia, seda suurem kiirus. ES energia tõstmine antud EX energia korral, tõstab katalüüsi kiirust. ES energia kasvule aitavad kaasa: a) entroopiavähenemine ES moodustumise tulemusena b) ES destabiliseerimine struktuuriliste deformatsioonide, desolvatatsiooni ja elektrostaatiliste efektide tõttu Valgu denaturatsioon nõrkade vastasmõjude katkemine Valgu hüdrolüüs kovalentsete (peptiid)sidemete katkemine Milliste faktorite mõjul valk denatureerub?Valgu denaturatsiooni e. nõrkade vastasmõjude katkemist põhjustavad: ekstreemne pH (happed-alused) ja temperatuur, tugevate ioonsete sidemete tekitajad, tugevate H-sidemete tekitajad, orgaanilised solvendid. V. ENSÜÜMIKINEETIKA. (Õpik lk 81-88, 100-108) 1. Keemilise kineetika põhimõisted - reaktsiooni kiirus, kiiruskonstandid, reaktsiooni järk. I ja II järku reaktsioonide võrrandid ja kiiruskonstandid.
väljasadestumist ei toimunud. Munavalgu lahuse keskkond on neutraalne ja sadestumine toimub kuumutades. 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega Orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. Töö käik: Katseklaasi valatakse 2 ml munavalgu lahust. Tilgakaupa lisatakse orgaanilist solventi (selle katse puhul atsetooni) ja loksutatakse pidevalt sademe tekkimiseni. Seejärel lahjendatakse katseklaasi sisu veega ja jälgitakse, kas tekkinud sade lahustub või mitte. Tulemus: Sade jäi alles. Järelikult oli reaktsioon pöördumatu
Hapet mitte lisatud munavalgu lahus denatureerus kuumutamisel pöördumatult ning toimus väljasadestumine. 1.1.8.Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega Teoreetilised alused Veega segunevad orgaanilised solvendid (nt. etanool, atsetoon) kutsuvad valgumolekulis esile aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Valk dehüdratiseerumine ning valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja pidevalt loksutada denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub valk uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamisel vähendada. Töö käik Valasin katseklaasi 2 ml munavalgu lahust. Tilgutasin lahusele atsetooni kuni lahus läks õrnalt häguseks. Lisasin katseklaasi vett. Tulemus Veega lahjendamisel lahustus tekkinud sade uuesti, kuid üksikud tükid jäid siiski katseklaasi alles. Järeldus Toimus valgu pöörduv denaturatsioon, sest vees lahustuvat solventi lahjendati ja valgu dehüdratiseetmine taganes
valk interaktsioonid lakkasid ja väljasadestumist ei toimunud. Munavalgu lahuse keskkond on neutraalne ja seal sadestub kuumutades. 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega Etanool, atsetoon jt. veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad esile valgu dehüdratiseerumise, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. Töö käik: Katseklaasi valame 2 ml munavalgu lahust. Tilgakaupa ja segu pidevalt loksutades lisame orgaanilist solventi kuni sademe tekkimiseni. Seejärel lahjendame katseklaasi sisu veega ja jälgime, kas tekkinud sade lahustub või mitte. Tulemus: Lisades munavalgu lahusele atsetooni, tekib sade. Seejärel lahjendan veega, kuid sade ei lahustu ära
täpi (pI) väärtusest, siis ei pruugi denatureerunud valk lahusest välja ei sadestuda. 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega Orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. Töö käik: Katseklaasi valame 2ml munavalgu lahust. Tilgakaupa ja loksutades lisame orgaanilist solventi kuni sademe tekkimiseni (hägune sade). Seejärel lahjendame katseklaasi sisu veega. Tulemus: Sade jäi alles Järeldus: Sade ei lahustu uuesti, sest toimus pöördumatau denaturatsioon. Lisaks võib olla see seotud sellega, et orgaanilist
Antud katse tõestas, kuidas pH muutmisel valgu molekulid lahuses ei agregeeru ja valk ei sadene välja pöördumatul denaturatsioonil lahusest. 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega. Töö teoreetilised alused Veega segunevad solvendid põhjustavad valkude dehüdreerimist ja tekkib sade. Sadesti kontsentratsiooni vähenemisel lahustub tekkinud sade uuesti. Kui sadestit lisada ettevaatlikult ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, siis denatureerub valk pöörduvalt. Töö käik: · Katseklaasi valasin 2 ml munavalgu lahust. · Tilgakaupa ja segu pidevalt loksutades lisasin orgaanilist solventi (atsetooni). Lahus läks häguseks (tekkisis äiksed valged tükkikesed). · Lahjendasin katseklaasi sisu destilleeritud veega. Valge sade enam ei lahustunud. Järeldus: Tekkinud valge sade vee lisamisel enam ei lahustunud. See tähendab, et minu katses tekkis pöördumatu denaturatsioon
kuni algas pruunikasmusta kolloidsademe moodustumine. 4) Asetasin katseklaasi statiivi lisanduva sademe tekkimise ajaks. Tulemused: Katseklaasis tekkinud naatriumplumbaat Na2PbO2 reageeris munavalgu radikaalis sisalduva tioolrühmaga, mille tulemusena sadestus pruunikasmust pliisulfiid PbS. Katse tõestas tsüsteiini olemasolu munavalgus. 1.1.5 Valkude sadestumine trikloroäädikhappega Töö teoreetilised alused: Katse eesmärgiks oli jälgida, kas valk denatureerub ja sadestub lahuses või mitte. Katse põhimõte seisneb trikloroäädikhappe (TKÄ) (trikloroetaanhappe) kui denatureeriva reagendi lisamisel valgule, mille peptiidide molekulmass on alla 10 000. Töö käik: 1) Valasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, lisasin paar tilka CCl3COOH lahust. 2) Loksutasin ning tekkis valge sade. Tulemused: Valget sadet ei tekkinud, mis tõendab, et munavalgu peptiidide molekulmass on kõrgem kui 10 000
Töö käik: Katseklaasi valan 1 ml munavalgu lahust. Lisan 1 ml 10% NaOH, mõni tilk 1% CuSO 4 lahust ja loksutan. Tulemus: Pärast ainete segamist lahuse värmus muutus violetseks.See tähendab ,et lahusel on aluseline keskkond,lahus sisaldab valku,mis koosneb rohkem,kui kahest peptiidsidemest. 2.Ksantoproteiinreaktsioon(Mulderi reaktsioon) Mulderi reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete(Tyr,Trp,Phe) olemasolu valgus.Kontsentreeritud lämmastikhape lisamisel valk denatureerub pöördumatult ja sadestub.Soojendamisel toimub aromatsete tuumade nitreerumine.Moodustub nitrofenooli tüüpi ühend,mis on intensiivse kollase värvusega,käitub hape/alus indikaatorina,omandades aluselis keskkonnas oranzi värvuse. OH OH O Töö käik: Katseklaasi valan 1 ml munavalgu lahust. Lisan 5-6 tilka kontsentreeritud HNO 3, soojendan reaktsioonisegu
tekib piimjas sade. Võib järeldada, et munavalge pI>7. 1.8. Valkude sadestamine orgaaniliste lahustega Teoreetilised alused Etanool, atsetoon jt. veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. Orgaanilise solvendi lisamine ettevaatamatult kiiresti või suures koguses tekitab solvendi kõrge lokaalse kontsentratsiooni, võib toimuda valgu pöördumatu denaturatsioon ja sade ei lahustu enam täielikult. Töö käik Valasin katseklaasi 2 ml munavalgu lahust. Lisasin tilkhaaval atsetooni pidevalt loksutades kuni tekkis sade
lähedane, aga tegelekult denatureerimist ei toimunud, sest munavalgulahus oli rikkis. 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega Etanool, atsetoon jt. veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete (= fudrofoobsete) radikaalide poordumise molekulide valispinnale. Toimub valgu dehudratiseerumine, mistottu valk sadestub lahusest valja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, denatureerub valk poorduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vahendada. Orgaanilise solvendi lisamine ettevaatamatult kiiresti voi suures koguses tekitab solvendi korge lokaalse kontsentratsiooni, voib toimuda valgu poordumatu denaturatsioon ja sade ei lahustu enam taielikult. Töö käik Katseklaasi valasin 2 ml munavalgulahust. Lisasin orgaanilist sovendi (atsetoon), pidevalt loksutades ja tilgakaupa, kuni tekkis sade (lahus sai hägusaks)
pöördumatul denaturatsioonil lahusest välja. 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega. Veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine ja valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit lisada ettevaatlikult ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, siis denatureerub valk pöörduvalt. Tekkinud sade lahustub uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. Kui orgaanilist solventi lisada liiga kiiresti ja ettevaatamatult või liialt suures koguses võib toimuda valgu pöördumatu denaturatsioon ja sade ei lahustu enam täielikult. Töö käik: · Katseklaasi valasin 2 ml munavalgu lahust. · Tilgakaupa ja segu pidevalt loksutades lisasin orgaanilist solventi. Munavalgu lahusele lisasin tilkhaaval lahust
sest katseklaasi keskkonna pH ei erinenud palju valgu isoelektrilise täpi (pI) väärtusest. 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega Etanool, atsetoon jt. veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete (= hüdrofoobsete) radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. Orgaanilise solvendi lisamine ettevaatamatult kiiresti või suures koguses tekitab solvendi kõrge lokaalse kontsentratsiooni, võib toimuda valgu pöördumatu denaturatsioon ja sade ei lahustu enam täielikult. Töö käik: Katseklaasi valatakse 2 ml munavalgu lahust. Tilgakaupa ja segu pidevalt
sest katseklaasi keskkonna pH ei erinenud palju valgu isoelektrilise täpi (pI) väärtusest. 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega Etanool, atsetoon jt. veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete (= hüdrofoobsete) radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. Orgaanilise solvendi lisamine ettevaatamatult kiiresti või suures koguses tekitab solvendi kõrge lokaalse kontsentratsiooni, võib toimuda valgu pöördumatu denaturatsioon ja sade ei lahustu enam täielikult. Töö käik: Katseklaasi valatakse 2 ml munavalgu lahust. Tilgakaupa ja segu pidevalt
Tahkel söötmel kasvanud preparaadist võetakse steriilse külviaasaga veidi bakterikultuuri ning viiakse see esemeklaasil asuvasse veetilka ja segatakse hoolikalt. Vedelsöötmes oleva kultuuri puhul võetakse kuumutatud külviaasaga aseptiliselt tilk söödet esemeklaasile. Preparaati - õhukese suspensioonikihiga kaetud umbes 1 cm diameetriga ümarat laiku - kuivatatakse toatemperatuuril õhu käes. Vältida tuleb tugevat kuumutamist, sest termilisel töötlemisel valk denatureerub ja rakkude struktuur võib muutuda. Kuiv preparaat fikseeritakse, et · kinnitada mikroorganismid tugevalt klaasi külge ja vältida nende mahapesemist preparaadi värvimisel; · surmata mikroorganismid (NB! Eriti tähtis patogeensete mikroorganismidega töötamisel!); · muuta mikroorganismid vastuvõtlikuks värvimisele. Preparaate võib fikseerida kas kuumutamisega, metanooliga (2-3 min), etanooliga (10-15 min) või etanooli-eetri seguga töötlemise teel
rakuvaheainest – plasmast (ca 55%). 1. Vere vormelemendid e. vererakud: - arenevad kõik ühest tüvirakkude tüübist, - eristatakse 3 põhitüüpi: a. Punalibled e. erütrotsüüdid – ca 95 % kõigist vererakkudest (4,2 – 6,2 miljonit/cmm), ilma tuumata, kaksiknõgusa ketta kujulised, läbimõõt ca 7,5 mikronit, sisaldavad hemoglobiini, mis seob hapnikku (siis helepunane!) ja osalt ka süsihappegaasi (siis tumepunane!). Erütrotsüütide purunemisel (hemolüüsil) vabanenud hemoglobiin denatureerub – ei seo enam hapnikku! b. Valgelibled e. leukotsüüdid: - kokku 5 –9 t/cmm, eristatakse 5 põhitüüpi, palju alatüüpe, kõik mingil moel seotud organismi kaitsereaktsioonidega. Leukotsüütide põhitüübid: 1) Neutrofiilsed granulotsüüdid – diam. 10-12 mikronit, tuum 2- 4 osaline, ül.- fagotsütoos. 2) Basofiilsed granulotsüüdid – diam. 10-12 mikronit, tuum 2 osaline, ül. – eritavad histamiini – põletik!, ja hepariini – hüübimise takistamine
Pesen sadet etanoolidga. Suspendeerin 30 µl MQs. Mis juhtub erinevate biomolekulidega aluselises keskkonnas? Aluselise keskkonna loob E2 lahus. Selle tagajärjes bakteriraku membraani fosfolipiidid moodustavad mitsellid ja valgud denatureeruvad. NaOH denatureerib DNA kõrgemat järku struktuurid. Kuidas tagada, et välja puhastuks vaid meid huvitav plasmiidne DNA, mitte bakteri enda genoomne DNA. Peale E2 lahuse lisamist ei tohi liiga kaua inkubeerida. Muidu denatureerub ka plasmiidne DNA mis järgmises etapis sadeneb. Laboris puhastati plasmiidset DNA’d, aga saadud plasmiidi kogus tuli liiga väike. Mida korduskatses teisiti teha? E1 lahuse lisamise järel tuleb veenduda et lahusesse ei jääks tükke. Kõik peab olema piimjas mass. Muidu need tükid ei lüüsu täielikult. Jälgida, et peale E2 12 lisamist ei inkubeeriks liiga palju. Jälgida, et etanooliga pesteks kogemata sadet kaasa ei võta
isopropanooli. Segada. Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 10 min. (5) Eemalda supernatant täielikult (sademe vastaspoolelt) ja lisa sademe pesemiseks 40 l 75% isopropanooli, sega õrnalt (käega). (6) Tsentrifuugi uuesti 5 min. Ja eemalda supernatant täielikult. (7) Veendu, et sade on kuiv, ning lahusta see 20 l formamiidi lahuses (inkubeeri 37oC juures 5 min). (8) Kuumuta 95 oC, 2-3 min (DNA denatureerub, ahelad eralduvad) ja jahuta jääl. (9) Säilita selliselt saadud fluorestsents-märgitud DNA 4oC juures, kuni automaatsekvenaatorisse panemiseni. 15 Lisaülesanded: 5.1) Sekveneerimissegu sisaldab nii dNTP kui ddNTP, mis on nende erinevus? dNTP-desoksü, ddNTP-didesoksü (2' ja 3' asendites vesinikud, terminaatornukleotiid). ddNTP ei
Nukleotiidid – A, G, C, T, mida läheb DNA molekuli sünteesiks vaja; 2 praimerit (tavaliselt 15–25 nukleotiidi pikkused DNA lõigud ), millest üks on komplementaarne uuritava DNA-lõigu ühe otsaga ja teine on komplementaarne teise otsaga; puhverlahus, mis on keskkonnaks. PCR ETAPID 1) tuubis oleva dna denatureerimine. Temperatuur tõstetakse 90–95 °C juurde, mille käigus DNA biheeliks laguneb kaheks üksikahelaks - denatureerub. 2) Praimerite seondumine DNA ahelatega. Temperatuur langetatakse 50–70 °C juurde. 3) DNA süntees. Temperatuur tõstetakse 72 °C juurde, mis on Taq-polümeraasi „töötemperatuur“. Polümeraas saab alustada DNA sünteesi ainult praimerite vabast 3’ otsast ja seetõttu liikuda sünteesiga ainult ühes suunas. Tulemusena tekib mõlemale DNA üksikahelale komplementaarne ahel.
fikseerivad nõrgad sidemed katkevad. Denatureerumise temperatuur sõltub valgu loomusest ja keskkonna koostisest. - Etanool, atsetoon jt. veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete (= füdrofoobsete) radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. 12. Millele põhineb globuliinide ja albumiinide lahusest väljasadestamine (väljasoolastamine) neutraalsete sooladega? Sadestumise protsessi mõjutavad valgu hüdrofiilsus / hüdrofoobsus, laeng, molekulmass ja muud omadused. Nii sadestuvad globuliinid (NH4)2SO4 poolküllastunud lahuses, albumiinide sadestumiseks aga on vaja soola küllastunud lahust.
isopropanooli. Segada. Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 10 min. (5) Eemalda supernatant täielikult (sademe vastaspoolelt) ja lisa sademe pesemiseks 40 l 75% isopropanooli, sega õrnalt (käega). (6) Tsentrifuugi uuesti 5 min. Ja eemalda supernatant täielikult. (7) Veendu, et sade on kuiv, ning lahusta see 20 l formamiidi lahuses (inkubeeri 37oC juures 5 min). (8) Kuumuta 95 oC, 2-3 min (DNA denatureerub, ahelad eralduvad) ja jahuta jääl. (9) Säilita selliselt saadud fluorestsents-märgitud DNA 4oC juures, kuni automaatsekvenaatorisse panemiseni. 12 Lisaülesanded: 5.1) Sekveneerimissegu sisaldab nii dNTP kui ddNTP, mis on nende erinevus? dNTP- desoksüribonukleotiid- OH rühm puudub 2´asendis. ddNTP- didesoksüribonukleotiid- OH rühm puudub 2´ja 3´ asendites. Kuna ddNTP-l pole OH rühma 3´asendis ta ei ole võimeline moodustada fosfodiester sideme järgmisega nukleotiidiga. 5
Asetasin tuubid kasvama 37 °C inkubaatorisse. 53. 54. Minipreparatsioon aluselise lüüsi meetodil 55. Eesmärgiks on bakteris paljundatud plasmiidi välja puhastamine. Selleks kasutatakse erinevaid lahuseid, mis muutuvad pH-d ja mille lisamise tagajärjel paljud fragmendid, mis saastavad plasmiidse DNA, tekitavad sadet ning neid on lihtne eraldada. 56. Aluselise lüüsi meetodil on tähtis see, et pH muutmisel bakteri genoomne DNA denatureerub kuid plasmiidse DNA ahelad jäävad seotuna teineteisega. Kui muuta pH esialgseks väärtuseks, siis bakterite genoomsed DNA molekulid agrigeeruvad ja tekitavad sadet soolade mõju tagajärjel ja plasmiidsed DNAd renatureeruvad tagasi. Nüüd fuugimisel lihtne genoomset DNAd eraldada plasmiidsest. 1. Võtsin kasvanud epsis bakterikultuur, fuugisin bakterid põhja 2 min maksimumpööretel ning eemaldasin pipetiga sööde sademe kohal. 2
14. Nimeta vähemalt 3 substraati, milledel kasvades annab E. coli positiivse vastuse? Laktoos, β-D-glükuroniidid, briljantroheline, sapisoolad. 15. Kuidas käituda siis, kui E. coli tuvastamisel indooltest annab positiivse vastuse, kuid GUR aktiivsus puudub? gusA geen on defektne. 16. Miks peab PCR-il kasutama kahte praimerit? DNA-l on kaks ahelat. 17. Miks peab PCR-il kasutama termostabiilset DNA polümeraasi? DNA denatureeritakse 94-98 kraadi juures. Tavaline polümeraas denatureerub. 18. Miks valmistatakse elektroforeesi puhul geel puhvris, mitte tavalises vees? pH stabiilsuse tagamiseks, PCR toimub ainult kindlal pH-l. 19. Kuidas eristada DNA-fragmente geelelektroforeesil? Molekulid tuleb geelis nähtavaks tuua. Agaroosi kasutatakse maatriksina. 20. Miks voolutatakse geelelektroforeesil paralleelselt reeglina ka suurusmarkerit? Suurusmarker koosneb kindlaksmääratud suurusega molekulide segust, saab määrata meie proovi molekuli suurust. 21
annaabi.ee 
