Biokeemia - Valgud ja süsivesikud (2)

TTÜ keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Biokeemia
Laboratoorne töö nr: 1
Töö pealkiri:
Valkude ja süsivesikute reaktsioonid
Õpperühm:
Töö teostaja:
Õppejõud:
Terje Robal
Töö teostatud:
07.02.2012
Protokoll esitatud:
Protokoll arvestatud:
1. AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA
Kvalitatiivsete reaktsioonide abil saab kindlaks teha mingi keemilise elemendi, funktsionaalse rühma, ühendi või ühendite rühma olemasolu või puudumist uuritavas materjalis. Hinnatakse, iseloomuliku värvusreaktsiooni teket, sademe või hägu moodustumist, gaasi eraldumist, muid silmaga nähtavaid muudatusi. Kvalitatiivse analüüsi puhul pole tavaliselt vaja reagente täpselt mõõta, piisab silmamõõdust ja suurusjärguga arvestamisest.
1.1 VALKUDE REAKTSIOONID
Valgud on polüpeptiidid, mille „ehituskivid” aminohapped on omavahel ühendatud peptiidsidemetega. Peptiidside tekib aminohapete karboksüülrühma ja aminorühma vahel, eraldub vesi. Erinevaid valkude koostises sisalduvaid aminohappeid on 20. Vahel leidub valkudes ka üldlevinud aminohapete hüdroksü-, metüül-, fosforüül- jt derivaate. Valkude puhul võib eristada primaarset, sekundaarset , tertsiaarset ja kvaternaarset struktuuri. Need struktuurid on fikseeritud nõrkade vastasmõjude ja keemiliste sidemetega. Valgu ruumilise struktuuri lagunemist nimetatakse denaturatsiooniks, mis võib põhjustada valgu väljasadenemist. Valgu peptiidsidemete lagunemist nimetatakse valgu hüdrolüüsiks. Valkude kindlakstegemiseks kasutatakse värvusreaktsioone, väljasadestamist, väljasoolastamist, üld- ja erireaktsioone.
1.1.1 Biureediraktsioon
Ühendid, mis sisaldavad kaht või enamat peptiidsidet, moodustavad aluselises keskkonnas Cu2+-ioonidega violetse kompleksi.
Töö käik: Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust. Lisatakse 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust. Katseklaasi sisu loksutatakse hoolikalt.
Järeldus: Segu värvus violetseks ja sellest võib järeldada, et lahus sisaldas kaht või enamat pepiidsidet, mis moodustasid aluselises keskonnas Cu2+-ioonidega violetse kompleksi.
1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon )
See reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus. Kontsentreeritud lämmastikhappe lisamisel denatureerib valk pöördumatult ja sadestub. Katseklaasi sisu soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine. Moodustub intensiivselt kollase värvusega ühend, mis käitub hape /alus indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas oranži värvuse.
Töö käik: Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust ja lisatakse 5–6 tilka kontsentreeritud HNO3 . Reaktsioonisegu loksutatakse ja soojendatakse kuni valge sade värvub kollaseks. Segu jahutatakse, lisatakse NH4OH lahust kuni ammoniaagi lõhna ilmumiseni ja loksutatakse hoolikalt.
Järeldus: Alguses oli lahus helekollane, pärast tumekollane. Kollaseks värvus nitrofenooli tüüpi ühend, mis käitub hape-alus indikaatorina ja omandab aluselises keskkonnas oranži värvuse. Järelikult leidus valgus aromaatset tuuma sisaldavaid aminohappeid.
1.1.3 Milloni reaktsioon
Milloni reaktiivi on elavhõbe(II)nitraadi lahus lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid (nt Tyr radikaalid. Türosiini leidub enamikes valkudes ning seega toimub nendega Milloni reaktsioon, mille puhul lahus sade valgulahuses värvuvad soojendamisel roosakaks kuni tume(telliskivi)- punaseks.
Töö käik: Ühte katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust, teise 1 ml želatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisatakse 5–6 tilka Milloni reaktiivi. Reaktsioonisegu soojendatakse.
Järeldus: Munavalgu lahus sisaldab Türosiini radikaale, sest lahus värvus soojendamisel roosaks.
1.1.4 Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon
Sulfhüdrüülreaktsioon näitab tsüsteiini (Cys) esinemist valgus. Tsüsteiini radikaalis sisalduv sulfhüdrüül- e tioolrühm (-SH) annab hõlpsasti leeliselises hüdrolüüsis sulfiidioone, mis Pb2+-ioonide juuresolekul moodustavad musta või tumepruuni ülipeene pliisulfiidi (PbS) sademe.
Töö käik: 2 ml Pb(CH3COO)2 0,5 %-lisele lahusele lisatakse ettevaatlikult tilgakaupa 10 %-list NaOH lahust kuni sade kaob ja lahuses moodustub naatriumplumbaat Na2PbO2. Seejärel lisatakse katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, loksutatakse ja soojendatakse kuni hakkab moodustuma pruunikasmust sade. Statiivis sademe moodustumine jätkub.
Järeldus: Valgus sisaldub tsüsteiine, sest tioolrühm moodustas Pb2+-ioonidega pruunjasmusta sademe (PbS).
1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroäädikhape (TKÄ) denatureerib valke ja sadestab peptiide, mille molekulmass on üle 10000. Seepärast saab TKÄd kasutada valkude eraldamiseks madalmolekulaarsetest lämmastikuühenditest nagu valgu hüdrolüüsi produktid.
Töö käik: Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust ja lisatakse mõni tilk CCl3COOH lahust. Loksutatakse.
Järeldus: Tekkis valge sade. Järelikut on tegemist valguga, mille molekulmass on üle 10000.
1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Neutraalsete soolade kõrged kontsentratsioonid põhjustavad valkude pöörduvat denaturatsiooni, millega kaasneb väljasadestumine lahusest. Sadestumist mõjutavad valgu hüdrofiilsus/hüdrofoobsus, laeng, molekulmass ja muud omadused. Nii sadestuvad globuliinid (NH4) 2SO4 poolküllastunud lahuses, albumiinid aga küllastunud lahuses.
Töö käik: 2 ml munavalgu lahusele lisatakse sama palju (NH4)2SO4 küllastunud lahust, loksutatakse ja jäetakse 5 minutiks seisma. Tekkinud globuliinide sade filtritakse (piisab poolest lahusest). Saadud filtraadile lisatakse kristalset (NH4)2SO4 ja loksutatakse kuni soola kristallid enam ei lahustu.
Järeldus: Küllastunud lahuse korral tekkis sadet märkimisväärselt rohkem kui poolküllastunud lahuse korral. Järelikult on munavalgus rohkem albumiine kui globuliine ning globuliinid on hüdrofoobsemad kui albumiinid.
1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Kõik valgud denatureeruvad kõrgel temperatuuril pöördumatult. Tavaliselt kaasneb denatureerumisega valgu väljasadestumine lahusest. Kui aga keskkonna pH väärtus erineb tunduvalt valgu isoelektrilise täpi (pI) väärtusest, siis ei pruugi denatureerunud valk lahusest välja ei sadestuda, sest pI-st oluliselt erineva pH väärtusega keskkonnas omandavad kõik valgumolekulid ühesuguse laengu („+“ või „-“), valk-valk interaktsioonid lakkavad, agregatsiooni ja väljasadestumist ei toimu.
Töö käik: Kahte katseklaasi valatakse 2 ml munavalgu lahust. Ühte katseklaasi lisatakse 1 ml kontsentreeritud etaanhapet. Mõlemaid katseklaase kuumutatakse vesivannil sademe tekkimiseni.
Järeldus: Sadestumine toimus ilma äädikhappeta munavalgu lahuses, sest teises katseklaasis oleva munavalgu lahuse pH-d muutis äädikhape, mille tõttu erines keskkonna pH väärtus tunduvalt valgu pI väärtusest.
1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega
Orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada , denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada.
Töö käik: Katseklaasi valatakse 2 ml munavalgu lahust. Tilgakaupa lisatakse orgaanilist solventi ja loksutatakse pidevalt sademe tekkimiseni. Seejärel lahjendatakse katseklaasi sisu veega.
Järeldus: Sade jäi alles. Järelikult oli reaktsioon pöördumatu. Selle põhjuseks võis olla solvendi kõrge lokaalne konsentratsioon .
1.2 SÜSIVESIKUTE REAKTSIOONID
Süsivesikud koosnevad ainult süsinikust, vesinikust ja hapnikust. Vastavalt struktuurile jaotatakse neid mono - , oligo- ja polüsahhariidideks. Monosahhariidid täidavad organismis energeetilist rolli, kuuluvad koensüümide ja nukleiinhapete koostisesse. Ühtlasi on monosahhariidid ka oligo- ja polüsahhariidide „ehituskivideks”. Oligosahhariidide molekulid koosnevad mõnest (2–10) monosahhariidi molekuli jäägist (omavad samuti energeetilist rolli), polüsahhariidid (energeetiline varuaine ja taimeraku ehitusmaterjal) aga sadadest või tuhandetest lihtsuhkru molekulidest. Enamus süsivesikute määramiseks kasutatavaid reaktsioone tugineb karbonüülrühma esinemisele molekulis. Teine osa baseerub heterotsükliliste aldehüüdide furfuraali või 5-hüdroksümetüülfurfuraali moodustumisele süsivesikute kuumutamisel tugeva mineraalhappe juuresolekul. Mõlemad aldehüüdid moodustavad kondenseerumisel fenoolidega värvilisi ühendeid.
1.2.1 Molisch'i test
Molisch'i testi võib lugeda süsivesikute kvalitatiivse analüüsi põhitestiks, kuna reaktsiooni saab teha nii mono-, oligo- kui polüsahhariidid, isegi nukleiinhapete ja glükoproteiinidega. Väävelhappe toimel suhkrud dehüdreeruvad, moodustades kas furfuraale või 5-hürdoksümetüülfurfuraale, mis moodustavad purpurse kihi uuritava lahuse ja happe piirpinnale.
Töö käik: Võetakse kaks katseklaasi ja neisse valatakse 2 ml erinevate süsivesikute lahust. Mõlemasse katseklaasi lisatakse 5–6 tilka Molisch'i reaktiivi. Katseklaaside sisu loksutatakse. Hoides katseklaasi kaldasendis lisatakse ettevaatlikult tilkhaaval 1 ml kontsentreeritud väävelhapet. Hape peab voolama mööda katseklaasi külge selle põhja uuritava lahuse alla. Katseklaasi segu ei tohi loksutada!
Järeldus: Happe ja lahuse piirpinnale tekkis purpurne reaktsiooniprodukt. Maltoosi oma heledam kui sahharoosi oma. Purpursest kihist võib järeldada süsivesikute olemasolu mõlemas lahuses.
1.2.2 Osasoonide saamine
Osasoonid on süsivesikute derivaadid, mis tekivad redutseeriva ehk taandava suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga. Osasoone moodustavad ka taandavad oligosahhariidid . Osasoonid kristalluvad lahustest välja. Igal suhkrul on iseloomulikud osasoonid. Reaktsioon on kaheetapiline – esmalt toimub reaktsioon C-1 paikneva aldehüüdrühma kaudu ja formeerub hüdrasoon C-1 positsioonis. Teine etapp hõlmab C-2 asendis oleva hüdroksüülrühma oksüdeerumist karbonüüliks ja selle kaudu ka C-2 asendis hüdrasooni formeerumist. Reaktsioon vajab fenüülhüdrasiini liiga ja pikemaajalist kuumutamist.
Töö käik: Kahte katseklaasi valatakse 2 ml erineva taandava suhkru lahust. Mõlemasse lisatakse ~0,1 g tahket fenüülhüdrasiini ja ~0,2 g kristallilist naatriumatsetaati ning loksutatakse kuni tahked ained on lahustunud. Segusid kuumutatakse veevannis, aegajalt loksutades. Seejärel jahutatakse jäävannis. Kui osasoonid on hakanud juba moodustuma, pole vaja segu enam loksutada. Moodustunud osasoonide kristallide kuju tehakse kindlaks mikroskoobis.
Järeldus: Galaktoosi osasoonid on suuremad kui Laktoosi omad. Galaktoosi kristallid on ühtlasema suurusega ja piklikud (kiirelised). Laktoosi kristallide hulgas on nii piklikke kui ka väiksemaid ümaramaid kristalle.
1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon
Taandavate suhkrute aldehüüdrühm taandab mitmete metallide sooli. Ammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest sadestub metalliline hõbe aldehüüdide toimel välja, moodustades katseklaasi pinnale hõbepeegli.
Töö käik: Hoolikalt pestud katseklaasi valatakse 1ml 1%-list AgNO3 lahust, lisatakse 0,5 ml kontsentreeritud NH4OH lahust ja loksutatakse. Seejärel lisatakse 1 ml glükoosi lahust. Segu loksutatakse ja soojendatakse ettevaatlikult veevannis. Positiivse reaktsiooni puhul sadestub taandunud hõbe katseklaasi seintele peeglina.
Järeldus: Katseklaasi pinnale tekkis hõbeda kiht. ’
1.2.4 Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega .
Taandavate suhkrute määramisel on üheks levinumaks reaktiiviks leeliseline Fehlingi reaktiiv , mis saadakse Fehlingi I lahuse (CuSO4 vesilahus ) ja Fehlingi II lahuse (leeliseline K,Na-tartraadi vesilahus) kokkusegamisel. Tekkiv vask(II)-tartraatkompleks reageerib aldooside või ketoosidega. Vaba aldehüüd- või toimel vask taandub, andes vask(I)oksiidi, mis punase sademena lahusest välja sadestub. Suhkur ise aga oksüdeerub reaktsiooni käigus vastavaks happeks . Mitte taandatava suhkru hüdrolüüsi saab kiirendada kas ensümaatiliselt või happe toimel kõrgel temperatuuril.
Töö käik: Kahte katseklaasi valatakse 1ml sahharoosi lahust, ühte neist lisatakse 1 tilk kontsentreeritud HCl. Loksutatakse ja hoitakse mõlemat lahust 5 minutit veevannis. Seejärel lisatakse mõlemasse katseklaasi 1 ml Fehlingi I ja 1 ml Fehlingi II lahust ja loksutatakse hoolikalt. Katseklaasides olev lahus omandab intensiivse sinise värvuse. Katseklaase soojendatakse uuesti veevannil kuni ühes katseklaasis tekib tugev punane sade.
Järeldus: Punane sade tekkis HCl-iga lahuses, sest seal tekkis vask(II)tartaatkompleks. Üldiselt sahharoos Fehlingi reaktiiviga ei reageeri, kuid selle eest reageerivad tema hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos . Sahharoosi lahuses, kuhu lisati HCl-i, toimus kõrgel temperatuuril hüdrolüüs. Hüdrolüüsi tulemusel saigi selles katseklaasis tekkida ja punane sade.
1.2.5 Barfoed' reaktsioon
Suhkrute reaktsioon Barfoed' reaktiiviga võimaldab eristada taandavaid monosahhariide oligosahhariididest. Nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske üksnes monosahhariidid. Reaktsioon Barfoed' reaktiiviga annab punase vask(I)oksiidi Cu2O sademe.
Töö käik: Võetakse kaks katseklaasi ning ühte valatakse 1 ml monosahhariidi lahust ja teise taandava oligosahhariidi lahust. Mõlemale lisatakse 3 ml Barfoed' reaktiivi. Segatakse ja hoitakse kuumal veevannil maksimaalselt 5 minutit. Jälgitakse Cu2O sademe moodustumist. Monosahhariidide korral peab sade moodustuma 2–3 minuti jooksul.
Järeldus: Kasutasin fruktoosi ja maltoosi. Sade tekkis 3 minuti jooksul fruktoosi lahuses. Järelikult on fruktoos taandatav monosahhariid . Ta taandab nõrgas happelises keskkonnas vaske.
1.2.6 Selivanoff 'i reaktsioon
Suhkrute kuumutamisel tugevate mineraalhapete juuresolekul moodustuvad furfuraalid. Tekkivad ühendid reageerivad mitmealuseliste fenoolidega, andes värvilisi produkte. Selleks kasutatakse näiteks Selivanoff'i reaktiivi, mis sisaldab soolhapet, kondenseeriva agendina resortsinooli e benseen-1,3-diooli [C6H4(OH)2] ja katalüsaatorina FeCl3. Reaktsiooni tulemusena tekkiva ühendi värvus varieerub punakaspruunist tumepruunini. Reaktsioon toimub ketoosidega kiiremini kui aldoosidega.
Töö käik: Võetakse 2 katseklaasi, ühte neist valatakse 1 ml fruktoosi lahust, teise sama hulk glükoosi lahust. Lisatakse 2 ml Selivanoff'i reaktiivi, loksutatakse ja soojendatakse 4...5 minutit keeval veevannil.
Järeldus: Fruktoosi lahus läks kiiresti intensiivseks punaseks, glükoosi puhul toimus lahuse punaseks värvumine aeglaselt ja ka värv polnud nii intensiivne kui fruktoosi puhul. Järelikult on fruktoos ketoos ning glükoos on aldoos.
1.2.7 Tärklise reaktsioon joodiga
Tärklistele moodustab joodiga intensiivseid lillakas-siniseid komplekse, mis on tingitud polüsahhariidi ahelate keerdumisest joodi molekulide ümber. Kõrgel temperatuuril kompleks laguneb ja kaotab värvuse, kuid tegemist on pöörduva. Joodiga värvuvad ka taimsest materjalist eraldatud tärkliseterakesed. Värvununa on neid mikroskoobis lihtsam vaadelda.
A. Katseklaasi valatakse 4–5 ml tärkliselahust ja lisatakse 1 tilk joodilahust. Segu loksutatakse ja kuumutatakse keemiseni. Seejärel katseklaasi alumine pool jahutatakse jäävee vannil või veejoa all.
B. Mikroskoobi alusklaasile kantakse erinevate tärkliste või tärkliserikka materjali proovid. Lisatakse 1 tilk lahjendatud joodilahust, mille liig kõrvaldatakse filterpaberi tükikesega. Preparaadid kaetakse katteklaasidega. Klaasi alla ei tohi jääda õhumulle. Proove vaadeldakse mikroskoobis suurendusega 15 x 8.
Järeldus A: Tärklis moodustas joodiga sinise kompleksi, mis lagunes kõrgel temperatuuril, kuid taastus jahutades külma veejoa all.
B: Kartuli tärkliseterad olid ebaühtlase suurusega ja suuremad. Maisi omad seevastu ühesuurused ja kartuli teradest väiksemad.