Biokeemia protokoll 1.1 ja 1.2 (0)

Valkude reaktsioonid.
Valgud on polüpeptiidid, mis koosnevad omavahel peptiidsidemega seotud aminohapetest. Valkudes sisalduvaid aminohappeid on 20 ning nad erinevad üksteisest radikaaldie struktuuri poolest.
Valkude:

• primaarne struktuur iseloomustab aminohapete valikulist järjekorda
  
• sekundaarne struktuur polüpeptiidahela üksikute lõikude korda ja
  
• tertsiaarne struktuur kogu valgumolekuli ruumilisust.
  

Kui molekul koosneb enam kui ühest polupeptiidahelast moodustuvad oligomeersed valgud, mis omavad ka kvaternaarset struktuuri. Ruumilised struktuurid on fikseeritud nõrkade keemiliste sidemete ja vastasmõjudega. Kui valgu ruumilises struktuuris grupeeruvad ümber ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgad sidemed, aga säilivad aminohappeid ühendavad peptiidsidemed, siis sellist lagunemist nimetatakse denaturatsiooniks. Taastumine on renaturatsioon.
Valkude reaktsioonide tüübid:

• kvantitatiivsed reaktsioonid -Kvalitatiivse analüüsi meetodid ei nõua reeglina reagentide täpset doseerimist (kaalumist, pipeteerimist), vaid piirduda võib silmamõõduga ning suurusjärgu arvestamisega. mis tähendab kvantitatiivne , mis kvalitatiivne?
  
• kvalitatiivsed reaktsioonid- Kvalitatiivsed reaktsioonid võimaldavad kindlaks teha mingi keemilise elemendi, funktsionaalse rühma, ühendi või ühendite rühma olemasolu või puudumist uuritavas materjalis.( värvusreaktsioonid , väljasadestamine, väljasoolastamine )
  

Kvalitatiivseid reaktsioone on kahte tüüpi:

• universaalsed ehk üldreaktsioonid, mis on omased kõikidele valkudele ja
  
• spetsiifilised ehk erireaktsioonid , mis on iseloomulikud ainult teatud aminohapetele valgu molekulis või vastavas lahuses.
  

Buireedireaktsioon
Biureedireaktsiooni annavad kõik ained, mis sisaldavad vähemalt kahte peptiidsidet. Leeliselises keskkonnas annab valk Cu(II)ioonidega sinakasvioletse värvuse, valgu mittetäieliku hüdrolüüsi produktid aga roosa värvusega biureedikompleksi.
Cu2+ ioonid seostuvad nelja peptiidsideme koostisesse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Struktuur?
Töö käik:
Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust. Lisatakse 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust. Katseklaasi sisu loksutatakse hoolikalt.
Tulemus: CuSO4 lisamisel muutus lahus lillaks.
Järeldus: Segu värvus violetseks ja sellest võib järeldada, et lahus sisaldas kaht või enamat pepiidsidet, mis moodustasid aluselises keskonnas Cu2+-ioonidega violetse kompleksi.

Mulderi reaktsioon .
See reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus. Kontsentreeritud lämmastikhappe lisamisel denatureerib valk pöördumatult ja sadestub. Katseklaasi sisu soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine. Moodustub intensiivselt kollase värvusega ühend, mis käitub hape /alus indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas oranži värvuse.
Töö käik: Katseklaasi valame 1 ml munavalgulahust ja lisame 6 tilka kontsentreeritud HNO3 . Loksutame ja soojendame, mille pärast valge sade värvus kollaseks. Seejärel jahutame segu ja lisame NH4OH lahust ja loksutame.
Tulemus: HNO3 lisamisel tekkis valge sade ning soojendamisel muutus segu kollakaks, NH4OH lisamisel värvus muutus intensiivsemaks, lõpuks oranžiks.
Järeldus: Kui me soojendame meie segu, toimub aromaatsete tuumade nitreerimine ja moodustub nitrofenooli tüüpi ühend, mille värvus on kollane. Kui me lisame NH4OH lahust, nitrofenool käitub leeliselises keskkonnas kui hape ja lahus värvub oranziks.
Munavalgu lahuses sisaldusid aromaatsete tuumadega aminohapped.

Milloni reaktsioon
Milloni reaktiivi on elavhõbe (II)nitraadi lahus lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid (nt Tyr radikaalid. Türosiini leidub enamikes valkudes ning seega toimub nendega Milloni reaktsioon, mille puhul lahus sade valgulahuses värvuvad soojendamisel roosakaks kuni tume(telliskivi)- punaseks.
Töö käik: Võtame 2 katseklaasi, ühte valame 1ml munavalgu lahust, teise 1ml zelatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisame 6 tilka Milloni reaktiivi. Segusid soojendatakse 40-50 kraadini.
Tulemus: Millioni reaktiivi lisamisel tekkis munavalgu lahuses sade, soojendamisel värvus sade roosakaks. Želatiini lahuses muutusi ei toimunud.
Järeldus: Munavalk andis positiivse Milloni reaktsiooni, mis on seotud sellega, et munavalgu lahus sisaldab aromaatsest tuuma sisaldavat aminohapet (Tyr, mis esineb enamiku valkude koostises). Aga zelatiin jäi muutumatuks, sest zelatiin ei sisalda aromaatset tuuma omavaid aminohappeid.

Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon
Sulfhüdrüülreaktsioon näitab tsüsteiini (Cys) esinemist valgus. Tsüsteiini radikaalis sisalduv sulfhüdrüül- e tioolrühm (-SH) annab hõlpsasti leeliselises hüdrolüüsis sulfiidioone, mis Pb2+-ioonide juuresolekul moodustavad musta või tumepruuni ülipeene pliisulfiidi (PbS) sademe.
Töö käik: 2ml Pb( CH3COO )2 0,5%-lisele lahusele lisame tilgakaupa 10%-list NaOH lahust kuni tekkiv Pb(OH)2 sade kaob. Lisame katseklaasi 1ml munavalgu lahust, loksutame ja soojendame mõne minuti vältel.
Tulemus: Segu kuumutamisel hakkas tekkima pruun sade, sademe tekkimine jätkus ka katseklaasi statiivi seisma jätmisel.
Järeldus: Meil on positiivne sulfhüdrüülreaktsioon, mis tähendab, et meie valgus on tsüsteiin (Cys). Pruun värvus on seotud sellega, et sulfiidioonid (tekkisid leeliselise hüdrolüüsi tõttu) reageerisid Pb2+ ioonidega.

Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroäädikhape ( TKÄ ) denatureerib valke ja sadestab peptiide, mille molekulmass on üle 10000. Seepärast saab TKÄd kasutada valkude eraldamiseks madalmolekulaarsetest lämmastikuühenditest nagu valgu hüdrolüüsi produktid.
Töö käik: Katseklaasi valame 1ml munavalgu lahust ja lisame mõni tilk CCl3COOH lahust. Loksutatakse.
Tulemus: Moodustus valge sade.
Järeldus: Valgu sade tekkis, sest valk denatureeris. Toimus valgu eraldamine/ väljasadenemine madalmolekulaarsetest lämmastikühenditest ( TKÄ abil). Seega valgu molekulmass on üle 10000.

Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Neutraalsete soolade kõrged kontsentratsioonid põhjustavad valkude pöörduvat denaturatsiooni, millega kaasneb väljasadestumine lahusest. Sadestumist mõjutavad valgu hüdrofiilsus/ hüdrofoobsus , laeng, molekulmass ja muud omadused. Nii sadestuvad globuliinid (NH4) 2SO4 poolküllastunud lahuses, albumiinid aga küllastunud lahuses.
Töö käik: 2ml munavalgu lahusele lisame 2ml (NH4)2SO4 küllastunud lahust, loksutame ja jääme 5 minutiks seisma. Tekkis globuliinide sade. Filtreerime sade filterpaberiga. Saadud filtraadile lisame kristelset (NH4)2SO4 kuni kontsentratsiooni saavutamiseni. (lisame väikeste portsjonitena soola ja loksutame katseklaasi hoolikalt. Toimingut korrame seni, kuni soola kristallid enam ei lahustu.
Tulemus: (NH4)2SO4 küllastunud lahuse lisamisel tekksi nõrk hägu . Kristalse (NH4)2SO4 lisamisel filtraadile tekkinud albumiinide sade oli intensiivsem.
Järeldus: Kuna valkude sadestamist sooladega mõjutavad erinevad tegurid sadestusid globuliinid poolküllastunud lahuses, albumiinid sama soola küllastunud lahuses. Tekkinud sademehulkade põhjal saab öelda, et albumiinide sisaldus munavalgus oli suurem.

Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Kõik valgud denatureeruvad kõrgel temperatuuril ja vastav temperatuur oleneb valgu loomusest ja keskkonna koostisest. Tavaliselt kaasneb valgu väljasadestumine.
Tavaliselt kaasneb denatureerumisega valgu väljasadestumine lahusest.
Töö käik: Kahte katseklaasi valame 2ml munavalgu lahust. Ühte katseklaasi lisati 1ml konts. äädikhapet. Mõlemaid katseklaase kuumutati keeval vesivannil .
Tulemus: Lahus, kus oli ainult munavalk, värvus valgeks (hägune), aga lahusega, kus oli munavalk ja äädikhape ei juhtunud midagi.
Järeldus: Valku denatureerimine sõltub temperatuurist ja pH-st. Kaitses me näeme, et happelises keskkonnas (pH