Valgud ja süsivesikud, protokoll (0)

Valgud ja süsivesikud, protokoll 1
Olivia- Stella Salm, 179471LAAB
Valkude sissejuhatus
Valgud koosnevad omavahel peptiidsidemega ühendatud aminohapetest. Peptiidside moodustub ühe aminohappe karboksüülrühma reageerimisel teise aminorühmaga (eraldub vesi). Peptiidside on osalise kordsuse tõttu planaarne ning enamasti trans-konformatsioonis. Valkudes on 20 üldlevinud aminohapet ning mõned ebaharilikud aminohapped (hüdroksü- jt derivaadid ). Valgul on primaarne, sekundaarne tertsiaarne ja kvaternaarne struktuur. Ruumilisi struktuure hoiavad koos nõrgad keemilised sidemed ja vastasmõjud. Valgu ruumilise struktuuri lagunemist nimetatakse denaturatsiooniks. Selle käigus grupeeruvad ümber või katkevad ruumilist struktuuri koos hoidvad nõrgad sidemed. Denatureerumine võib põhjustada valgu väljasadenemist lahusest. Valgu peptiidsideme lagunemist nimetatakse valgu hüdrolüüsiks. Valkude detekteerimiseks lahuses kasutatakse näiteks värvusreaktsioone, väljasadestamist ja väljasoolamist. Selliseid kvalitatiivseid reaktsioone on universaalseid ning spetsiifilisi. Kuna valdav osa valke sisaldab kõiki 20 aminohapet, siis on ka erireaktsioonid kasutatavad enamiku valkude tuvastamiseks.
Praktiline osa
Biureedireaktsioon
Ühendid, mis sisaldavad kaht või enamat peptiidsidet, moodustavad aluselises keskkonnas Cu2+ -ioonidega violetse kompleksi. Tegemist on üldreaktsiooniga
Leeliselises keskkonnas moodustavad Cu2+ - ioonid valgumolekulidega violetse, lühikese ahelaga peptiididega aga roosa värvusega biureetkompleksi. Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses
Töö käik
Võtan katseklaasi 1 ml munavalge lahust, lisan 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõne tilga 1%-list CuSO4 lahust. Loksutan hoolikalt. Lahus muutub tumesinisest lillaks. Katse näitas, et tegemist on pika valgumolekuliga.
Ksantoproteiinreaktsioon
Ksantoproteiinreaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüpofaan ja fenüülalaniin) olemasolu valgus. Kontsentreeritud HNO3 lisamisel valk denatureerub ja sadeneb. Katseklaasi sisu soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine. Moodustunud ühend on kollase värvusega ja käitub alus-happe indikaatorina, olles leeliselises keskkonnas oranž.
Töö käik
Valan katseklaasi 1 ml munavalgu lahust ja lisan 5-6 tilka kontsentreeritud HNO3. Loksutan ja soojendan reaktsioonisegu kuni tekkinud valge sade värvub kollaseks. Jahutan segu ning lisan NH4OH lahust kuni ammoniaagi lõhna ilmumiseni, loksutan hoolikalt. Lahus oleks pidanud minema oranžiks, kuid ma lisasin valest pudelist NH4OH lahust.
Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
TKÄ ehk trikloroetaanhape denatureerib ja sadestab välja valke, kuid mitte peptiide, mille molekulmass on alla 10000, seega saab TKÄ-d kasutada selleks, et eraldada valke madal-molekulaarsetest lämmastikühenditest.
Töö käik
Valan katseklaasi 1 ml munavalgu lahust ja lisan 3 tilka TKÄ lahust. Loksutan, tekkib valge sade.
Valkude väljasoolamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Neutraalsete soolade kõrged kontsentratsioonid põhjustavad valkude pöörduvat denaturatsiooni, millega kaasneb väljasadestumine lahusest (väljasoolamine). Globuliinid sadestuvad poolküllastunud lahuses, albumiinide sadestamiseks on aga vaja soola küllastunud lahust.
Töö käik
2 ml munavalgu lahusele lisan võrdse mahu (NH4) 2SO4 küllastunud lahust, loksutan ja jätan viieks minutiks seisma. Tekkinud globuliinid eraldan filtrimise teel, filtrin umbes poole lahusest. Saadud filtraadile lisan kristalset (NH4)2SO4 kuni küllastumiseni ( vahepeal loksutades). Moodustub albumiinide sade. Mõlemad sademed olid valged, kuid albumiinide sisaldus oli kindlasti kõrgem, kui globuliinide oma, sest globuliinide sadestamise puhul oli lahus veel võrdlemisi läbipaistev, kuid albumiinide sadestamisel oli sadet rohkem ja läbipaistvus väiksem.
Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Kõik valgud denatureeruvad kõrgel temperatuuril pöördumatult, sest ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgas keemilised sidemed katkevad. Denatureerumise temperatuur sõltub valgu loomusest ja keskkonna koostisest. Tavaliselt kaasneb denatureerumisega valgu väljasadestumine lahusest. Kui aga keskkonna pH väärtus erinev tunduvalt valgu isoelektrilise punkti väärtusest, siis ei pruugi väljasadestumist toimuda. Valgu isoelektriline punkt näitab keskkonna pH väärtust, mille juures on lahuses tsvitterioonid. Sellest tingituna sadenevad valgumolekulid lahusest välja. Kui aga lahuse pH on oluliselt erinev pI-st, siis väljasadestumist ei toimu.
Töö käik
Valan kahte katseklaasi 2 ml munavalgu lahust. Ühte lisan 1 ml kontsentreeritud äädikhapet, seejärel kuumutan mõlemaid katseklaase vesivannil. Happega katseklaasis ei teki sadet kuumutamisel, kuid teises tekkis üsna kiiresti valge hägu. Happega katseklaasis oli pH ilmselt oluliselt madalam kui valgu pI ning seetõttu ei sadenenud selles katseklaasis midagi.
Süsivesikute sissejuhatus
Süsivesikud koosnevad süsinikust, vesinikust ja hapnikust.Vastavalt struktuurile jaotatakse neid mono -, oligo -, ja polüsahhariidideks. Monosahhariidide üldvalem on Cx(H20)y. Molekuli keemiliselt ehituselt on nad kas lineaarsed polühüdroksüaldehüüdid, polühüdroksüketoonid või molekulisisese tsüklisatsiooni tulemusel tekkivad tsüklilised poolatsetaalid või poolketaalid. Tänu aldehüüd- või ketorühma esinemisele omavad kõik monoosid redutseerimisvõimet. Oligosahhariidid koosnevad 2-10-st monosahhariidi jäägist, polüoosides on aga sajad või tuhanded monomeerid ühinenud pikkadeks sirgeteks või hargnenud ahelateks. Oligosahhariidide oluloseks klassifitseerimise tunnuseks on vaba poolatsetaalse või poolketaalse küdroksüülrühma esinemine või puudumine molekulis, mille järgi neid jaotatakse redutseerivateks ja mitteredutseerivateks. Oligo- ja polüsahhariidides on monomeerid omavahel seotud O-glükosiidsidemega.
Enamus süsivesikute kvalitatiivseks määramiseks kasutatavaid reaktsioone baseerub karbonüülrühma esinemisele molekulis. Leeliselises keskkonnas redutseerivad suhkrud metallide ioone ning teisi oksüdeerijaid, neutraalses või happelises keskkonnas toimub suhkrute oksüdatsioon ilma molekuli destruktsioonita. Teine osa analüüsi meetoditest põhineb heterotsükliliste aldehüüdide furfuraali või 5-hüdroksümetüülfurfuraali moodustumisele süsivesikute kuumutamisel tugeva mineraalhappe juuresolekul. Moodustuvad värvilised ühendid.
Praktiline osa
Molisch’i test
See on süsivesikute kvalitatiivse analüüsi põhitest- kõik sahhariidid annavad positiivse tulemuse, samuti ka nukleiinhapped ja glükoproteiinid. Väävelhappe toimel suhkrud dehüdreeruvad, moodustades furfuraale või 5-hüdroksümetüülfurfuraale. Produktid reageerivad edasi α-naftooliga(C10H7OH), moodustades purpurse kihi uuritava lahuse ja happe piirpinnale.
Töö käik
Võtan kahte katseklaasi kahe erineva süsivesiku lahuseid 2 ml, mõlemasse lisan 6 tilka Molisch’i reaktiivi ja loksutan. Hoides katseklaasi kaldasendis lisan tilkhaaval 1 ml kontsentreeritud väävelhapet, ilma katseklaasi loksutamata. Fruktoosil tekis lilla kiht happe pinnale, glükoosil punane.
Punane – glükoos Lilla – fruktoos
Osasoonide saamine
Osasoonid on süsivesikute derivaadid, mis tekkivad redutseeriva suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga. Osasoone moodustavad monoosid ja taandavad oligosahhariidid. Osasoonid kristalluvad lahusest hõlpsasti välja. Osasoonide kuju järgi on võimalik eristada ka neid suhkruid, mille stereostruktuurid erinevad vaid ühe kiraalse tsentri konfiguratsiooni poolest. Reaktsioon vajab fenüülhüdrasiini liiga ja pikemaajalist kuumutamist.
Töö käik
Valan kahte katseklaasi 2 ml erineva taandava suhkru lahust, kaalun mõlemasse 0,1 g tahket fenüülhüdratsiini (glükoosi lahusele 0,11 g ja maltoosi lahusele 0,09 g) ja 0,2 g kristallilist naatriumatsetaati (glükoosi lahusele 0,21 g ja maltoosi lahusele 0,22 g). Loksutan kuni ained on enam-vähem lahustunud (lõpuni ei lahustunud), hoian kuumas veevannis täpselt 40 minutit aeg-ajalt loksutades (kuni osasoonide tekimiseni). Peale keetmist panen jäävanni jahtuma 25-ks minutiks. Moodustunus osasoonide kristallide kuju tehakse kindlaks mikroskoobis.
Selleks kantakse preparaadiklaasile üks tilk osasooni suspensiooni, liigne vedelik eemaldatakse filterpaberi tükikese abil ja kristallid kaetakse ettevaatlikult (mitte tugevalt surudes!) katteklaasiga. Valmistatud osasooni preparaate vaadeldakse suurendusega 15 x 8 või 15 x 20 ja joonistatakse üles kristallide kuju.
Glüloosi osasoonid on nagu tumedad kõrred, üsna pikad sealjuures . Laktoosi osasoonid meenutavad veidi väikese lapse joonistatud lilli, need on ümmargused ja kollakad, mitte eriti pikad läbimõõdult (võrreldes glükoosi osasoonidega). Glükoosi osasooni välimus langeb kindlasti kokku kirjanduses oleva infoga , laktoosi oma on aga veidi teistsugune. Võib-olla on erinevus tingitud suurenduse erinevusest.
Glükoosi osasoonid Laktoosi osasoonid
Benedict ’i test suhkrute määramiseks
Reaktsioon Benedict’i reaktiiviga võimaldab eristada taandavaid ja mittetaandavaid suhkruid. Taandavad suhkrud reageerivad tsitraadiga komplekseerunud vaseiooniga. Vaba aldehüüd- või ketorühma (poolatsetaalse või -ketaalse hüdroksüülrühma) toimel vask taandub, andes punase värvusega vask(I)oksiidi, mis lahusest välja sadeneb. Suhkur oksüdeerub reaktsioonil vastavaks happeks.
Positiivse reaktsiooni annavad ainult taandavad suhkrud. Selleks et näiteks sahharoosiga positiivset tulemust saada, tuleb ta hürolüüsida (näiteks ensümaatiliselt või happe toimel kõrgel temperatuuril). Tekib invertsuhkur (glükoosi ja fruktoosi suhe 1:1).
Töö käik
Kahte katseklaasi valan 1 ml sahharoosi lahust, ühte neist lisan 1 tilga kontsentreeritud HCl. Kuumutan katseklaase 5 minutit ca 80 kraadi juures, lisan 2 ml Benedict’i reaktiivi, loksutan ja soojendan katseklaase vesivannil. Punane sade tekib katseklaasis, millele lisasin soolhapet, sest HCl-i toimel sai sahharoosist invertsuhkur. Benedict’i reaktiiv tõestas, et selles lahuses on taandavad suhkrud. Teises katseklaasis ei ilmunud sadet, sest seal oli sahharoos , mis on mittetaandav suhkur ja ei anna reaktsiooni Benedict’i reagendiga.
Barfoed’ reaktsioon
Sellega eristatakse taandavaid monosahhariide oligosahhariididest, kuna nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske vaid monosahhariidid . Reaktsioonil Barfoed’ reaktiiviga tekib punane Cu2O sade.
Töö käik
Võtan kaks katseklaasi, ühte lisan 1 ml monosahhariidi lahust (fruktoos) ja teise 1 ml taandava oligosahhariidi lahust ( maltoos ). Lisan mõlemale 3 ml Barfoed’ reaktiivi, segan ja panen kuumale vesivannile maksimaalselt viieks minutiks. Fruktoosi sisaldavas katseklaasis tekis sade kahe minuti jooksul, maltoosi sademe tekkimist ma ära ei oodanud, kuid ka sinna oleks võinud sade lõpuks tulla, sest oligosahhariidis toimuks glükosiidsideme hüdrolüüs ja vabanevad monosahhariidid taandavad vaske.
Tärklise reaktsioon joodiga
Tärklis moodustab joodiga lillakas -siniseid komplekse, sest polüsahhariidi ahelad keerduvad joodi molekulide ümber. Selline kompleks laguneb kõrgematel temperatuuridel (kaotab ühtlasi värvuse). Joodiga värvuvad ka kartulitest ja teraviljadest pärit tärkliseterakesed ning värvunult on tärklise taimset päritolu võimalik selgeks teha terasid mikroskoobi all võrreldes.
Töö käik

Valan katseklaasi 5 ml tärkliselahust, lisan tilga joodilahust, loksutan ja kuumutan keemiseni. Seejärel jahutan katseklaasi alumist poolt jäävee vannil. Algne lahus on tumesinine, keetmise järel peaaegu värvitu ning alumise otsa jahutamisel moodustub katseklaasi alumisse otsa tumesinine kiht. Tegemist on pöörduva reaktsiooniga. Algul moodustuvad joodi ja tärklise kompleksid, kuumutades need lahunevad ning hiljem jahutades taastuvad .

Mikroskoobi alusklaasile kantakse erinevate tärkliste või tärkliserikka materjali (jahu) proovid . Lisatakse 1 tilk lahjendatud (helekollast) joodilahust, mille liig kõrvaldatakse filterpaberi tükikesega. Preparaadid kaetakse katteklaasidega nii, et õhumullid klaasi alla ei jääks ja vaadeldakse mikroskoobis suurendusega 15 x 8.
Kartuli tärklis Maisi tärklis
Kartuli tärklise terad tunduvad piklikumad ja üldises plaanis suuremad. Nende suurus varieerub märgatavalt. Maisi tärklise terad on võrdlemisi väikesed ja ümarad, suurus ei varieeru sellisel määral.