Rakendusbioloogia jaotusmaterjalid (0)

RAKENDUSBIOLOOGIA
Koostas Kersti 
Veskimets
Funktsionaalne toit
… toidule on lisatud midagi, et see 
parandaks inimese tervist.
Biokeefir,  biojogurt  – lisatud 
probiootilisi baktereid, mis 
parandavad seedimist, 
immuunsüsteemi.
“Hellus” sisaldab Eestis 
patenteeritud Lactobacillus 
fermentum ME-3, mis hävitab 
düsenteeria, salmonelloosi ja 
ateroskleroosi…
Ka  meditsiin  kasutab biotehnoloogiat juba 
terve sajandi
•  Antibiootikumid  seentest ja bakteritest 
(penitsil iin ja etratsükliin)
  A. Fleming avastas penitsil iini 1929.a 
• Alkaloidid, mida kasutatakse 
Parkinsoni  tõve ja  migreeni  raviks.
Põllumajanduses
• Silo valmistamisel
• Mügarbakterid küntakse mulda.
•  Biotõrje (taimekaitsevahendid) –
     - seentest saadud  ensüümid  peletavad 
putukaid ja seenhaigusi.
    - feromoonidega meelitatakse  kahjurid  lõksu
    - bakteritoksiin  (Bt-toksiin on parim) tapab 
putukaid selektiivselt ja inimesele mõju ei 
avalda.               
Tööstuses
Bioplast – laguneb looduses kiiremini.  
Biogaas  – prügimägede lagundamine 
bakterite abil        
Bakterid  lagundavad prügimäed alkoholiks.
B. toodavad ämblikuniiti – ülitugev materjal
Bakterid toodavad puuvilla.
Bakterid puhastavad maaki .
Bakterid puhastavad reovett (aktiivmuda).
Pesuvahendites
Ensüümid saadakse bakteritest ja seentest. 
Intelligentsed pesupulbrid  lagundavad 
lipiide, valke, polüsahhariide jne.
RAKU- JA EMBRÜOTEHNOLOOGIA
Kloonimine  on geneetiliselt identsete 
järglaste saamine,
Ka vegetatiivne paljunemine on kloonimine.
Meristeempaljundus  on uuem meetod:
Meristeemrakud on diferentseerumata  ja 
paljunemisvõimelised.
Nad on totipotentsed – “kõikvõimelised”.
Hübridoomitehnoloogia ja 
monoklonaalsed antikehad
• Teatud antigeen  viiakse hiiresse.
• Hiires tekivad vastavaid  antikehi tootvad 
B- lümfotsüüdid .
• B-lümfotsüüdid viiakse kokku kasvajarak-
kudega  – need on hübridoomid.
• Selektiivsöötmel jäävad ellu ja paljunevad 
ainult hübridoomid.
• Nüüd on  puhaskultuur  ühte tüüpi antikehi  
tootvatest, hästi paljunevatest rakkudest.
Monoklonaalsete antikehade
Antigeen
                             tootmine
Rakud  ühen-
datakse
Kasvajarakud
Antikehasid tootvad
paljunevad hästi
 B-lümfotsüüdid
http://www3.niaid.nih.gov/
topics/immuneSystem/frontiers
Monoklonaalsed antikehad
Images.htm
Monoklonaalseid antikehi kasutatakse:
1. Antigeenide määramiseks
2. Teatud valkude puhtaks eraldamiseks
3. Haiguste avastamiseks
4. Rasedustestis. Testjoon värvub ainult siis, 
kui proov  sisaldab kooriongonadotropiini.
http://thejenniferblog.files.wordpress.com/2008/01/pregnancy_test.jpg
Embrüosiirdamine  ja viljastamine in  vitro
Superovulatsioonil küpseb lehmal palju 
munarakke. Pärast seemendamist pestakse 
embrüod välja. Nende hulgast valitakse 
parimad ja viiakse surrogaatemasse.
Katseklaasi (in vitro) viljastamise meetod 1970a
Miks tehakse?
Heade omadustega loomalt saab palju järglasi.
Embrüod säilivad sügavkülmutatult, saab 
transportida.
Embrüosiirdamine inimesel
Esimene laps sündis Inglismaal 1978.a., 
Eestis 1993.a.
Nüüd on neid üle 2 miljoni.
Lastetuid abielupaare on Eestis 10 – 20%.
Asendusema ei ole Eestis lubatud.
In vitro viibib  embrüo  ainult 2-5 päeva.
Munarakud võetakse otse munasarjast 
nõelpipetiga.
Imetajate kloonimine
Embrüonaalkloonimine:
Varase  embrüo  rakud  on totipotentsed, need 
eraldatakse ja viiakse mitmetesse 
emasloomadesse.
Igast rakust saab areneda tervikorganism.
Kõik nad on geneetiliselt omavahel samad.
Tuumkloonimine
Tuumkloonimine
s.t. keharaku tuuma viimisel munarakku on 
saadud uus organism.
1997.a. saadi esimene tuumkloonitud 
lammas  Dolly .
Katse näitas, et imetajate tuumas on kogu 
organismi arenguks vajalik aktiivne 
geneetiline info olemas.
Kas Dollyl on ainult tuumadoonori geenid ?
Udararakust võeti tuum
Rakud liideti elektri-
impulsiga
Munaraku tuum 
eemaldati
Rakk jagunes 
nagu embrüo
Embrüo siirdati 
Sündis kloon – 
kolmandale lambale
Dolly
http://www.millerandlevine.com/cloning/dolly-fig-13-13.jpg
Kloonitud on hi ri, küülikuid, kasse,  lambaid , 
kitsi,  sigu , muulasid, veiseid, hobuseid jne.
Pole suudetud  kloonida  ahve,  konni .
Tegelikult enamus katsetustest ei  õnnestu : nt. 
hobune saadi 328 katsetuse tulemusel.
Kloonide eluiga on  normaalsest  lühem. Miks?
Tegelikult ei ole  kloonid  väljanägemiselt ja 
omadustelt identsed.
Ka ühemunakaksikute sõrmejäljed on 
erinevad.
Miks kloonida?
1. Transgeensete organismide saamiseks
2. Mudelhiired  luuakse , et leida ravimeid 
inimese haigustele.
3.  Hävimisohus olevate li kide säilitamiseks: 
võetakse hävimisohus looma tüvirakust 
tuum ja viiakse see lähedase li gi 
munarakku. Munarakk si rdatakse tagasi 
looma emakasse. Sünnib hävimisohus liigi 
esindaja.
Inimese kloonimine?
Miks ebaeetiline?
Põhjenda , kas Georg Otsa,  Lennart  Meri,  Arvo  
Pärdi kloonid oleksid  samade  omadustega?
Reproduktiivsel kloonimisel saadakse 
tervikorganism.
Terapeutilisel kloonimisel tehakse embrüo in 
vitro ja kasutatakse sel e rakke raviotstarbel.
Sel ine kloonimine legaliseeriti Suurbritannias 
2001.a. 
Tüvirakud ja rakuteraapia
Selgroogsete tüvirakud on diferentseerumata 
või vähediferentseerunud rakud.
Rakuteraapia – tüvirakke kasutatakse 
kahjustunud  kudede taastamisel.
Parimad on  sügoodi  esimestel jagunemistel 
tekkinud rakud – totipotentsed.
Embrüoplasti rakud võivad ainete toimel 
areneda igaks koeks.
Nabaväädi tüvirakud saavad ka erinevateks 
kudedeks . (säilitatakse  sügavkülmas )
Täiskasvanu tüvirakud:
Ammu on tuntud vereloometüvirakud.
Viimased  uurimused näitavad, et kõikides 
kudedes on omad tüvirakud, ka närvikoes.
Mida aktiivsem inimene, seda enam 
neuronid paljunevad!
Pealegi saab juba ükskõik millise keharaku 
suunata teatud ainetega arenema ükskõik 
mis suunas.
Sea rakkudega saab ka inimesi ravida!
GEENITEHNOLOOGIA
…on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi 
saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) 
ühest organismist teise või muudetakse 
muul viisil geene saadakse GMO.
Organisme, kellele on  viidud  võõraid geene, 
nim. transgeenseteks.
Esimene  transgeenne   bakter  tehti 1973.a.
Nokautorganism – organism, kellel teatud 
geen on maha surutud.
Geenide ülekandmine on võimalik 
restriktaaside abil.
Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad 
bakterid enesekaitseks – need lõikavad 
DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad 
üheahelalised otsad  – “kleepuvad otsad”.
Selliste otstega DNA juppe on komplemen-
taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita.
Erinevate DNA-de liitmisel saame 
rekombinantse DNA.
Restriktaas
Vektor
Lõigatud DNA
Restrikataas
(sama)
Lõigatud
Kleepuvad otsad ühinevad
vektor
Rekombinantne
plasmiid
Kuidas geenid kohale viia?
1. Bakteri plasmiidiga
2. Viirustega 
Kui neile on soovitud geen lisatud, nime-
tame teda geenivektoriks.
3. Kullapüstoliga
4. Taimedesse Agrobakteriga
Kuidas kergesti aru saada, et soovitud 
geen on üle kandunud?
Üle viidavale geenile on markergeen ka 
külge pandud (näiteks helenduv-GFP) 
Nüüd kasutataksegi GFP geeni  markerina:
Kui  uuritava geeni lõppu, enne stopp -
koodoneid, on sisestatud  GFP geen, siis 
vastava valgu süntees ei peatu enne, kui  
ka GFP-valk on valmis. 
Nii saab iga valgu translatsiooni toimumist  
organismis uurida.
Miks bakterirakus ei hakka inimese 
geen kohe tööle?
Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis 
on  intronid  ja eksonid. 
Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja 
ainult kokkuli detud eksonid moodustavad 
mRNA , mil e alusel sünteesitakse valk.
Kui tahame bakterisse geeni viia, siis peame selle 
mRNA alusel tegema DNA  - õnneks on 
avastatud pöördtranskriptaas, mis selle töö ära 
teeb.
Nüüd teeb bakter sama valku, mis see geen 
inimese rakuski teeb.
Bakterid toodavad inimese valke alates 
1978.a.
Esimene oli  insuliin .
Inimese  kasvuhormoon
Erütropoietiin  aneemia  raviks
Interferoon, mis reguleerib immuunsüsteemi
Vere hüübimisfaktorid
Difteeria  ja teetanuse  vaktsiin
Pärmseened teevad Bhepatiidi vaktsiini
Putukarakud toodavad papilloomi vaktsiini
Transgeensed loomad
Esimene transgeenne hiir saadi 1981.a. roti 
kasvuhormooniga kasvas 2 X suuremaks.
Miks hi ri kasutatakse kõige rohkem?
Transgeensete suurimetajate saamine on 
keerukas: munarakk  kahjustub , 
embrüosiirdamine ei ole sageli edukas jne.
Tarus plaanitakse luua  lehm , kes toodab 
insuliini (Sulev Kõks ja Ül e Jaakmaa).
Näited ravimeid tootvatest loomadest 
• GM- kitse  piimas antikehad kasvajate vastu
• GM-lehma piimas laktoalbumiin enneaegsetele 
lastele
• GM-sead toodavad inimese hemoglobiin
Geenitehnoloogia loomade 
tõuaretuses
• Sigade ja  lammaste  kaal kasvas 30%
• Kalkunite munevus suurenes
• Lihaloomad, kelle tailiha  ja rasva osakaal 
on täpselt määratud
• Forell jt kalad  kasvasid 2 korda 
suuremaks
Transgeensed taimed
Et saavutada:
   - putukaresistentsus Bt-toksiini määrav geen  on 
viidud taimesse ja mürke polegi vaja ( tomat , mais, 
puuvill , kartul ),
   - viirusresistentsus, (papaia)
   - herbitsiidiresistentsus ( peet , mais, puuvill, lina, 
raps , soja , riis )
   - suurem saagikus,
   - lamandumis- ja    külmakindlus ,
   - viljade pikem säilivusaeg
   
GM-taimede kasvatamise levik USA-s 
2005.a. seisuga:
• Soja 89%
• Mais 61% (maisi saagikus on tõusnud 30%)
• Puuvill 83%
• Riis 
• Raps 
• Suurimad kasvatajad: USA,  Argentiina , 
Kanada, Hiina.
Sordiaretuse ajaloost?
• 10 000.a. tagasi põllumajanduse algus – valiti 
juhuslikult.
• 19. saj. selekti vne ristamine
• 20. saj. algus mutagenees ja  selektsioon
• 1987.a. esimesed GM-taimed
• 1990-nendad GM-taimede levik USA-s, Aasias jm.
• 1998.a. EL keelustas kõik GMO-d.
• Nüüd on Euroopas lubatud, kui taodelda luba 
(ülikeeruline, meeletu paberi, aja ja raharaiskamine) 
GMO-aretuse poolt:
 
• Kiiremad tulemused
• Geenid teistelt liikidelt
• Geenide  avaldumist saab reguleerida
•  Teatakse  täpselt, millist geeni üle kantakse, 
mis muutub uues sordis.
• Põldudel kasutatakse vähem 
keskkonnamürke.
See on täppissordiaretus.
GMO-aretuse vastu:
• Kahjurid võivad muutuda immuunseks.
• Geenid võivad üle kanduda umbrohule.
• Erinevate organismide geenide  koostoime  
võib olla ettearvamatu.
• GM-taimede maitseomadused on 
tavaliselt halvemad.
Geeninokaut
Geen lülitatakse välja.
On loodud sadade geenide suhtes “nokauti 
löödud”  hiiri . 
Tehnika on keeruline: 
1. Geenivektor ( vigane  geen+ marker ) viiakse 
hiire  embrüonaalsetesse tüvirakkudesse.
2. Vektor satub ristsiirdega genoomi.
3. Selektiivsöötmel jäävad ellu mutantsed 
rakud, need on nokautrakud.
4. Nokautrakud siiratakse uude 
embrüoblasti
5. Tekib kimäärne embrüo
6. See embrüo viiakse hiire emakasse
7. Sünnivad kimäärsed hiired (neid hoitakse)
8. Järgneva ristamise tulemusena sünnib ka 
homosügootseid nokauthiiri.
• Mudelhiired – 
haiguste uurimiseks. .
• Organite 
kasvatamiseks
    GM-loomade baasil.
Geeniteraapia
Inimesel on teada üle 3000 päriliku puude.
Kaks võimalust:
1.  Asendada  haige geen tervega
2. Vaigistada haige geen.
Neid tegevusi ei  tehta  munarakuga, need ei 
pärandu järglastele.
On kohati häid tulemusi, kuid enamasti 
mitte.
Immuunpuudulikkuse ravi oli 1990.a. 
suhteliselt edukas
Parkinsonitõve ravi ajutiselt.
Geenivaigistamiseks kasutatakse  mikro -
RNA molekule. Kui mi-RNA-d ühinevad 
mRNAga, siis viimane lagundadakse.
Nii saaks ravida  Huntingtoni haigust.
Geenivaigistamine on täiesti uus suund!
Muid geenitehnoloogia rakendusi
1. Molekulaargeneetiline diagnostika
Enamasti põhineb mutantsete geenide 
äratundmisel.
DNA- kiibid  - võrdlus DNA- lõigud , mil ega patsiendi 
geene kõrvutada – saab tuvastada haiguse ja 
siis vastavalt määrata ravi.
Paljude haiguste puhul on see juba võimalik: 
rinnavähk , tsüstiline  fibroos , sirprakuline 
aneemia, kurtus, Huntingtoni tõbi jne.
Albiino   jänes hüppab  
Helenduv kärss
ringi nagu iga tavaline 
jänku , kuid pimedas toas 
UV-valgusel hakkab 
helenduma.
Embrüodiagnostika
2. DNA-sõrmejälgede metoodika
Võrreldakse 10 või enama lookuse pikkust: 
Lookusi saab DNA-st välja lõigata ja paljundada 
väga kiiresti polümerasse ahelreaktsiooni 
(PCR) meetodit kasutades.
Lõigatud fragmendid on erineva pikkusega, kuid 
lahuses  segamini .
See proov pannakse geeli,  geel pannakse 
elektrolüüsi vanni.
DNA-lõigud jooksevad + pooluse  poole, seda 
kiiremini, mida lühemad nad on.
PCR metoodika:
Ependorfis segatakse kokku: 
    nukleoti did (kõiki nelja erinevat)
    DNA- polümeraas
    oma DNA lahus
    praimerid -  lühikesed  DNA lõigud, mis on 
komplementaarsed analüüsitava DNA-
piirkonna mõlema “otsaga”.
Ependorf pannakse 3 tunniks PCR-masinasse.
  PCR-masinas toimub DNA  uuritavate  lõikude 
 paljundamine tänu pidevale temperatuuride 
vaheldumisele:
92oC - DNA denatureerub
58C - praimerid liituvad
72oC - DNA-polümeraas
     käivitab replikatsiooni.
   See  tsükkel kordub
   masinas 34 korda. 
Fragment , mida
PCR
 tahetakse paljundada
Kuumutamisel 90-ni 
DNA denatureerub
Praimerid ühinevad
 madalamal temp-l
DNA-polümeraas saab  replikatsiooni
 alustada ainult 3` otsast
Kuumutatakse 90 –ni, DNA denatureerub
Praimerid ühinevad
DNA-polümeraas replikeerib, 
alustades 3`otsast
Need 2 fragmenti 
on esimesed 
tulemused.
Tsüklit korratakse 
34X, saadakse
30 miljonit

Document Outline

• RAKENDUSBIOLOOGIA
• Funktsionaalne toit
• Ka meditsiin kasutab biotehnoloogiat juba terve sajandi
• Põllumajanduses
• Tööstuses
• Pesuvahendites
• RAKU- JA EMBRÜOTEHNOLOOGIA
• Hübridoomitehnoloogia ja monoklonaalsed antikehad
• Slide 9
• Slide 10
• Embrüosiirdamine ja viljastamine in vitro
• Embrüosiirdamine inimesel
• Imetajate kloonimine
• Tuumkloonimine
• Slide 15
• Slide 16
• Miks kloonida?
• Inimese kloonimine?
• Tüvirakud ja rakuteraapia
• Slide 20
• GEENITEHNOLOOGIA
• Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil.
• Slide 23
• Kuidas geenid kohale viia?
• Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud?
• Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle?
• Bakterid toodavad inimese valke alates 1978.a.
• Transgeensed loomad
• Näited ravimeid tootvatest loomadest
• Geenitehnoloogia loomade tõuaretuses
• Transgeensed taimed
• GM-taimede kasvatamise levik USA-s 2005.a. seisuga:
• Sordiaretuse ajaloost?
• GMO-aretuse poolt:
• GMO-aretuse vastu:
• Geeninokaut
• Slide 37
• .
• Geeniteraapia
• Slide 40
• Muid geenitehnoloogia rakendusi
• Albiino jänes hüppab ringi nagu iga tavaline jänku, kuid pimedas toas UV-valgusel hakkab helenduma.
• Embrüodiagnostika
• 2. DNA-sõrmejälgede metoodika
• PCR metoodika:
• Slide 46
• Slide 47
• Slide 48