Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega

Suviste, Inge

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega (0)

Tallinna Tehnikaülikool - Keemia - Biokeemia

1 Hindamata

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega

Süsivesikute reaktsioonid
1.1 Valkude reaktsioonid
1.2 Süsivesikute reaktsioonid
Süsiveikud, mis koosnevad vaid süsinikust, vesinikust ja hapnikust, on arvukas bioloogiliste ühendite rühm. Struktuurile vastavalt on need süsivesikud jaotatud mono - , oligo - ja polüsahhariidideks. Monosahhariidid ( monoosid e lihtsuhkrud) omavad organismis olulist energeetilist vormi ning on ka koensüümide ja nukleiinhapete koostises. Kõikide monosahhariidide üldvalem on Cx(H2O)y, kuid nad erinevad üksteisest stereomeetriliselt, mis tähendab, et funktionaalrühmad on erinevalt paigutaud. Sellepärast on omadused oluliselt erinevad. Aldehüüd- või ketorühma esinemise tõttu omavad kõik lihtsuhkrud redutseerimisvõimet.
Oligosahhariidide molekulid koosnevad monooside 2-10 jäägist (nt sahharoos, laktoos , maltoos , maltotrioos jt). Polüsahhariidides ehk polüooside on aga hoopis sajad või tuhanded monooside molekulid ühinenud pikkadeks sirgeteks või hargnenud struktuuriga ahelateks. Oligosahhariidid klassitsifeeritakse vaba hemi- e poolatsetaalse või poolketaalse hüdroksüülrühma molekulis esinemise või puudumise järgi. Vastavalt sellele jaotatakse oligosahariidid taandavateks ja mittetaandavateks.
Energeetilist rolli omavad sahharoos, laktoos ja maltoos on levinumad oligosahhariidid, mille lisamisel valgule post-translatoorse modifitseerimise käigus, tekivad glükoproteiinid. Oligosahhariidid on ka glükolipiidide koosseisus ning osalevad rakk -rakk äratundmises.
Tärklis ja glükogeen on energeetiliseks varuaineks, polüoosid on taimedes ka rakukesta ehituses.
Süsivesikute kvalitatiivne analüüs põhineb peamiselt karbonüülrühma olemasolul molekulis. Vastavalt reaktsioonitingimustele oksüdeeruvad suhkrud seejuures erinevateks produktideks . Suhkrud redutseerivad leeliselises keskkonnas metallioone ning teisi oksüdeerijaid. Suhkrumolekuli süsinikuahel selle reaktsiooni käigus aga lagunueb ning tekib mitmeta oksüdatsiooniproduktide segu. Kui on aga happeline või neutraalne reaktsioonikeskkond, siis suhkrute oksüdatsioon toimub ilma molekuli destruktsioonita ning saadusteks on erinevad happed .

Molisch’i test
Positiivse reaktsiooni annavad nii mono- , oligo- kui polüsahhariidid, lisaks ka nukleiinhapped ja glükoproteiinind. Tugevas happelises keskkonnas toimub pikapeale monosahhariidide vabanemine , sest väävelhappe toimel suhkrud dehüdreeruvad ning moodustavad furfuraale või 5-hüdroksümetüülfurfuraale. Seejärel reageerivad tekkinud produktid α-naftooliga.
Töö käik:

valan kahte katseklaasi 2 ml erinevate süsivesikute lahust ( glükoos ja saharoos)
lisan mõlemasse katseklaasi 5-6 tilka Molisch’i reaktiivi (α-naftooli lahus alkoholis) – tekkis sade
loksutan
lisan kaldasendis katseklaasi 1ml konts väävelhapet
väldin loksutamist – hape voolab lahuse alla ja moodustub sade, kuna hapestatud keskkonnas suhkrud dehüdreeruvad ning tekkinud 5-hüdroksümetüülfurfuraal reageerib α-naftooliga

Sahharoosiga moodustub tumelilla sade. Glükoosiga tekib helelilla sade.

Osasoonide saamine
Osasoomid on süsivesikute derivaadid, mis tekivad fenüülhüdrasiini reageerimisel taandava suhkruga. Osasoone moodustavad monoosid kui ka taandavad oligosahhariidid. Osasoonid kristalluvad lahusest välja ning nende omadused on lähedased lähtesuhkrule. Reaktsioon toimub kahes etapis .
Töö käik:

Valan kahte katseklaasi 2ml erinevaid taandavaid suhkruid ( 1% laktoos ja 1% maltoos)
Lisan mõlemale 0,1g fenüülhüdrasiini ja 0,2g kristallilist naatriumatsetaati
Loksutan tahkete ainete lahustumiseni
Panen reaktsioonid 40 min keevasse vette
Jahutan katseklaasid jäävannis
Vaatlen mikroskoobi all tekkinud osasoome

Laktoosi puhul tekib palju pehmeid kristalle (nägi välja nagu maakaart)
Vaatlesin ka glükoosi kristalle. Viimased olid sellised vihased , nagu okastraat .

Hõbepeeglireaktsioon
Redutseerivate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm taandab mitmete metallide sooli . Ammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest (Tolleni reagent) sadestub aldehüüdide toimel metalliline hõbe moodustades katseklaasi pinnale kerge peegli. Tolleni reaktiivis aktiivseks komponendiks diammiinhõbe(I) [Ag(NH3)2]+
Töö käik:

Valan katseklaasi 1ml 1% AgNO3 lahust
Lisan 0,5 ml konts NH4OH lahust
Loksutan
Lisan 1ml glükoosi lahust
Loksutan ja soojendan veevannis

Katseklaasi pinnale tekib hõbepeegel ning keskel kollakaspruunikas hägune lahus. Seega on glükoosis aldehüüdrühm olemas ning glükoos on ka taandav suhkur, kuna taandas [Ag(NH3)2]+
RCOH + 2[Ag(NH3)2]++ 2OH–?  RCOOH + 2Ag + 4NH3+H2O

Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega
Fehlingi reaktiiv (Fehlingi I lahus ( CuSO4 ) + Fehlingi II (leeliseline K, Na-tartraadi e Seignett’i soola vesilahus)) on levinud taanduvate suhkrute määramiseks. Tekkiv vask(II)- tartraatkompleks reageerib aldooside või ketoosidega ning vaba aldehüüd- või ketorühma toimel vask taandub – vask(I) oksiid (punane sade). Suhkur ise aga oksüdeerub vastavaks happeks .
Töö käik:

Valan kahte katseklaasi 1ml sahharoosi lahust
Ühte neist lisan ka 1 tilga konts HCl-i
Loksutan
Sahharoosi hüdrolüüsiks kuumutan 5 minutit vesivannil
Mõlemasse katseklaasi lisan Fehlingi reaktiivi: 1ml Fehlingi I ja 1ml Fehlingi II
Loksutan ja siis kuumutan

Hapestatud lahuses punast sadet ei teki, kuna ei sadestu Cu2O lahuse happelise keskkonna tõttu. Kuid lahuses, kuhu hapet ei lisatud, tekkis tugev punane vask(I)oksiidi sade. Seega mittetaanduv sahharoos hüdrolüüsus kuumutamise käigus ning tekkis invertsuhkur (fruktoos ja glükoos), mis on taandav suhkur. Sisalduva aldehüüdrühma toimel taandus vask vask(I)oksiidiks ning sadestus.

Barfoed’ reaktsioon
Monosahhariide oligosahhariididest eristamine on võimalik Barfoed’ reaktiiviga, kuna nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske üksnes monosahhariidid ning tulemusena sadestub punane Cu2O.
RCOH + 2Cu+2 + 2H2O  RCOOH + Cu2O + 4H+
Töö käik

Valan ühte katseklaasi fruktoosi
Teise katseklaasi lisan laktoosi
Lisan mõlemasse katseklaasi 3ml Barfoed’ reaktiivi
Segan ja panen kuumale veevannile 5minutiks

Fruktoosi lahuses sadestub kuumutades vask(I)oskiid kiirelt punasena, kuna tegu on monosahhariidiga. Laktoosi lahus jääb läbipaistvaks, kuna tegu on oligosahhariidiga, mis vaske ei taanda. Pikaajalisel kuumutamisel muutus ka laktoosi lahus õrnalt roosaks , sest oligosahhariid on kuumutamise käigus hüdrolüüsunud galaktoosiks ja glükoosiks, mis on monoosid ja taandavad vaske.

Selivanoff ’i reakstsioon
Pentoosidest moodustub kuumutamisel mineraalhapete juuresolekul heterotsükliline aldehüüd furfuraal, heksoonidest aga 5-hüdroksümetüülfurfuraal. Furfuraalid reageerivad polükondenseerivad mitmealuselistega fenoolidega, andes värvilisi produkte, mis efektiivsed suhkrute kvantitatiivsel määramisel. Sellepärast on kasutusel ka Selvanoff’i reaktiiv, milles soolhape ja kondenseeriva agendina resortsinool e benseen -1,3-diool [C6H4(OH)2] ning katalüsaatorina FeCl3. Reaktsioon kiirem aldoosidega kui ketoonidega ning saaduse värv varieerub punakaspruunis tumepruunini.
Töö käik

Valan ühte katseklaasi 1ml fruktoosi ( ketoos)
Teise 1ml glükoosi (aldoos)
Lisan mõlemale lahusele 2ml Selivanoff’ i lahust
Loksutan ja kuumutan 4-5 minutit keeval veevannil

Fruktoosi lahus värvub kiiremini punaseks, kuna tegu on ketoosiga. Seega on ketoosides lihtsam keeminlisi sidemeid lõhkuda, suhkur reageerib kiiremini ning tekib ka punane produkt.

Tärklise reaktsioon joodiga
Tärklis moodustab joodiga sinakas - lillasid komplekse. See on tingitud polüsahhariidi ahelate keerdumisest joodi molekulide ümber. Kõrgemal temperatuuril kompleks aga laguneb ja kaotab värvuse. Joodiga värvunud tärkliseterakesed on mikroskoobis paremini nähtavad ning nii on hõlpsam määrata tärklliseterakese analüüsida.
Töö käik
I

Valan katseklaasi 4 ml tärkliselahust
Lisan sellele tilga joodilahust: lahus värvuv tumesiniseks
Loksutan ja kuumutan keemiseni: lahus kaotab pöörduva reaktsiooni tõttu värvuse, kompleksühend dissotseerub
Lasen katseklaasi külma veejoa all jahtuda: tekib lilla põhi. Joodikompleks on tekkinud jahutamise tõttu.

Vaatlen mikroskoobi all kartulitärklise ja nisutärklise proove.

Kartulitärklise kristallid on suuremad ja ümmargusemad, nisutärklise kristallid aga pisemad ja nurksed.

Valkude reaktsioonid
Valgud on polüpeptiidid, mis koosnevad peptiidsidemega seotud aminohapetest. Peptiidsideme moodustavad ühe aminohappe karboksüülrühm ja teise aminohappe aminorühm. Peptiidsideme tekkimisel eraldub vesi, mistõttu on see kondensatsioonireaktsioon. Valkude koostises on 20 enamlevinut aminohapet, mida nim proteogeenseteks aminohapeteks.
Valgud täidavad oma funktsioone tänu iseloomulikele ruumilistele struktuuidele, mis tulenevad primaarsest struktuurist e aminohapete valikust ja järjestusest polüpeptiidahelas. Sekundaarstruktuur on aminohappeahela lokaalne korrapärastumine, tertsiaalstruktuur aga kogu valgu kolmemõõtmelise struktuuri iseloomustamine.Valgumolekulide ruumilised struktuuri on fikseeritud nõrkade keemiliste sidemetega ja vastasmõjudega.
Denaturatsioon on valgu molekuti ruumilise struktuuri osaline lagunemine. Nõrgad keemilised sidemed, mis fikseerivad ruumilist struktuuri, grupeeruvad ümber või katkevad. Peptiidsidemed aminohapete vahel aga säiluvad. Denaturatsioon võib vähendada valgu lahustutvust, mistõttu sadeneb denatureerunud valk lahusest välja. Kui valgu peptiidside katkeb, on tegu valgu hüdrolüüsiga.
Valkude detekteerimis kvalitatiivsed analüüsi meetodid:

värvusreaktsioonid
väljasadestamine (denatureerides, eraldades madalama molekulmassiga peptiide)
väljasoolastamine (valgufraktsioonide lahutamiseks)

Kvantitatiivsed meetodid:

universaalsed – omased kõikidele valkudele, nt biureedireaktsioon
spetsiifilised – teatud aminohappeid sisaldavatele valkudele, nt tiooli ja Milloni reaktsioon

Biureedireaktsioon
Kui ühendis on enam kui kaks peptiidsidet, moodustavad nad aluselises keskkonnas Cu2+ ioonidega violetse kompleksi. Üldreakstsioon ongi biureedireaktsioon just seepäerast, et on tingitud peptiidsidemete esinemisest. Biureetkompleksi värvus on tingitud Cu2+ioonide koordinatiivsest seostumisest nelja peptiidsidemete koostisse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses.
Töö käik:

valan katseklaasi 1ml munavalgu lahust
lisan 1ml 10%-list NaOH lahust, et reaktsioonikeskkond oleks aluseline
mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust ja loksutan - tekib lilla värvus

Lahus värvub lillaks, sest tekib biureetkompleks.

Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon)
See on reaktsioon aromaatseid tuumasid sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu kindlaktegemiseks valgus. Konts lämmastikhappe lisamisel denatureerub valk pöördumatult ja sadestub. Kuumutamisel toimub aga aromaatsete tuumade nitreerimine ning moodustunud nitrofenooli tüüpi ühend on kollase värvusega indikeerides hape/alus olukorda. Leeliselises lahuses omandab oranži värvuse.
Töö käik:

Valan katseklaasi 1ml munavalgu lahust
Lisan 5-6 tilka konts HNO3 lahust
Loksutan – tekib valge sültjas sade (denatureerunud valk)
Kuumutamise tagajärjel muutub sade helekollaseks (nitreeritud aromaatsed tuumad )
Lisan NH4OH kuni eraldub tugevalõhnaline ammoniaak – lahus muutub tumekollaseks ja aluseliseks, sest munavalgule happe lisamisel tekib valge sade, on lahuses valk, mis happe toimel denatureerub. Kuumutamisel nitreeritakse aminohapetes aromaatsed tuumad, mis aluse lisamisel indikeerivad lahuse aluselist keskkonda.

Milloni reaktsioon
Reaktsioonis kasutatav Milloni reaktiiv on elavhõbe(II)nitraadi lahus lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Reaktiiviga reageerivad fenoolselt hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid – valkudest türosiini radikaalid. Kuna Tyr on enamike valkude koostises, siis enamus valkudest annab ka positiivse Milloni reaktsiooni. Nimelt värvuvad valgu lahus või denatureerunud valgu sade soojendamisel roosast tumepunaseni. Milloni reaktiin on toksiline ka korrodeeriv.
Töö käik

Valan katseklaasi 1 ml munavalgu lahust
Teise katseklaasi 1 ml želatiini lahust
Lisan mõlemasse katseklaasi 5 tilka Milloni reaktiivi
Soojendan reaktsioonisegu 50 kraadini

Munavalgule Milloni lahuse lisamisel tekib valge sültjas sade, valk denatureerub. Kuumutamisel aga värvub valge sültjas sade roosakaks ning muutub tahkemaks. Seega on munavalgus türosiini.
Želatiinile Milloni reaktiivi lisamisel ei juhtu mitte midagi – valk ei denatureeru.

Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon
Positiivne reaktsioon näitab tsüsteiini (Cys) esinemist valgust. Tsüsteiini radikaalis esineb tiool – e sulfhüdrüülrühm (- SH). See allub kergelt leeliselisele hüdrolüüsile, andes sulfiidioone, mis Pb2+ - ioonide juuresolekul moodustavad musta või tumepruuni sademe (PbS). Vastavas katses kastutatakse Pb2+ -ioonide saamiseks pliietanaadi e pliiatsetaadi lahust. Ühend moodustab aluselises keskkonnas naatriumplubaadi(II), millest sadeneb valguga reageerides välja PbS.
Na2S + Na2PbO2 + 2H2O  PbS + 4NaOH
Töö käik

Valan katseklaasi 2 ml 0,5% pliietanaadi lahust
Lisan ettevaatlikult tilgakaupa 10%- list NaOH lahust, kuni tekkiv Pb(OH)2 sade kaob
Lisan 1ml munavalku
Loksutan ning seejärel soojendan mõned minutid : lahus muutub pruuniks

Algul pliietanaadi ja NaOH lahuse kokkusegamisel moodustub Pb(OH)2 sademena, kuid alust lisades muutub keskkond aluseliseks ning moodustub naatruimplumbaat Na2PbO2. Munavalku lisades reageerib naatriumplumbaat valgust vabanenud oleva sulfiidiooniga. Soojendamisel reaktsioon kiireneb ning lahusest sadeneb välja pruunikas PbS, mis indikeerib tioolrühma olemasolu munavalgus. Reaktsioon oli positiivne.

Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroäädikhape e trikoloetaanhape denatureerib hõlbsalt valke, kuid vaid peptiide, mille molekulmass on üle 10 000. Seetõttu saab trikloroäädikhapet kastutada valkude eraldamiseks madalmolekulaarsetest lämmastikuühenditest, nagu valgu hüdrolüüsi produktid.
Töö käik

Valan katseklaasi 1ml munavalgu lahust
Lisan tilga CCl3COOH lahust.
segan

Munavalgu lahusele trikloroetaanhapet lisades tekib valge sültjas sade. Seega valgu denaturatsioon õnnestus ning munavalgu molekulaarmass on üle 10 000.

Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Neutraalsed konts soolad (nt MgSO4 , (NH4) 2SO4 ja NaCl) denatureerivad valku pöörduvalt, sadestades denatureerunud valku lahusest välja. See ongi välasoolastamine. Sadestumist mõjutavad hüdrofiilisus, -foobsus, laeng jne. Näiteks globuliinid sadestuvad diammooniumsulfaadi poolküllastunud lahuses, albumiinid aga soola küllastunud lahusest.
Töö käik

Katseklaasi 2ml munavalku
Lisan 2ml (NH4)2SO4 küllastunud lahust
Loksutan ning jätan seejärel 5 minutiks seisma (tekib sade)
Filtreerin lahuse
Saadud filtraadile lisan kristalset (NH4)2SO4 kuni lahus on küllastunud (sool ei lahustu enam)

Munavalgule (NH4)2SO4 lahust lisades tekib poolküllastunud lahus ning tekivad globuliinid (sade), mille filtrin välja. Kristalse (NH4)2SO4 lisamisel lahusele kuni sool enam ei lahustu, on lahus küllastunud ning tekivad albumiinid – valged niitjad moodustised. Kuna poolküllastumata lahuses oli sade suurem, oli globuliinide hulk suurem. Seega on munavalgus enam globuliine kui albumiine.
1.1.5 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Kõrgetel temperatuuridel kõik valgud denatureeruvad pöördumatult, kuna ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgad sidemed katkevad. Denatureerumisega kaasneb ka väljasadestumine, kuid kui keskkonna pH väärtus erineb tunduvalt valgu isoelektrilise täpi (pl) väärtusest, siis ei pruugi denatureerunud valk lahusest välja sadestuda.
Valgu (pl) iseloomustab keskkonna pH väärtust, mille juures valgumolekulis on positiivsete ja negatiivsete laengute hulk võrdne – molekuli summarne laeng on 0. Seetõttu agregeeruvad valgu molekulid kergelt ning sadenevad välja, kuid kui pl on pH- st oluliselt erinev, omandavad kõik valgud ühesuguse laengu. Interaktsioonid valkude vahel lakkavad – agregatsiooni ei toimu. Seetõttu ei sadene ka denatureerunud valk.
Töö käik

Valan kahte katseklaasi 2 ml munavalgu lahust
Ühte neist lisan konts etaanhapet
Kuumutan mõlemat katseklaasi vesivannil

Lahus, millele lisasin hapet , jäi selgeks. Seega oli lahuse pH tunduvalt erinev valgu isoelekrtilisest täpist ning tekkisid ühesuguse laenguga valgud ning nendevahelised interaktsioonid katkesid. Agregeerumist ei tekkinud ning lahus jäi selgeks.
Lahus millele ma etaanhapet aga ei lisanud, muutus kuumutamisel häguseks. Seega denatureerus valk kuumuse toimel ning kuna lahuse pH oli sarnane valgu pI- ga, agregeerus ka valk ning tekkis sade.

Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega
Veega segunevad orgaanilised solvendid (nt etanool, atsetoon ) kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete ehk siis hüdrofoobsete radikaalide pöördumine molekulide välispinnale – valgu dehüdratiseerumine. Tekkinud sade lahustub taas, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamisel vähendada. Kui aga sadestit pidevalt loksutades lisada, denatureerub valk täielikult.
Töö käik

Valan katseklaasi 2 ml munavalgu lahust
Lisan tilgakaupa orgaanilist solventi (etanooli) – tekib sade
Seejärel lisan vett

Valgulahusele etanooli lisamisel tekkis lahuse pinnale valge vahutav sade, mis tähendab, et valk denatureerud. Vee taaskordselt lisamisel aga sade kadus, sest vähendasin orgaanilise solvendi etanooli kontsentratiooni lahuses. Kuna sade kadus, oli tegu pöörduva denaturatsiooniga.

.DOC Laadi alla originaalfail 14 lk · .doc · 33 allalaadimist

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #1

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #2

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #3

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #4

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #5

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #6

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #7

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #8

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #9

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #10

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #11

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #12

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #13

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega #14

50 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 50 punkti.

~ 14 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2011-12-08 Kuupäev, millal dokument üles laeti

33 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

Inge Suviste Õppematerjali autor

biokeemia esimene laboritöö

TÖÖ 1: AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA Juhendajad: Kaia Kukk Priit Eek 1.1. Valkude reaktsioonid 1.1.1. Biureedireaktsioon Ühendid, mis sisaldavad kaht või enamat peptiidsidet, moodustavad aluselises keskkonnas Cu2+ ioonidega violetse kompleksi. Kuna biureedireaktsioon on tingitud peptiidsidemete esinemisest, siis on ta valkude üldreaktsioon

Biokeemia

Rohkem sarnaseid

Kommentaarid (0)

Kommentaarid sellele materjalile puuduvad. Ole esimene ja kommenteeri

Kõik kommentaarid

.DOC Laadi alla originaalfail 14 lk