Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega, valkude reaktsioonid, süsivesinikute reaktsioonid (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Keemiainstituut
Biorgaanilise keemia õppetool
Laboratoorne töö Nr.1
Protokoll
Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega
Valkude reaktsioonid
Süsivesinikute reaktsioonid
Ann Lakspere
120959YASB
Juhendaja : Tiina Randla
Kaia Kukk
Tallinn 2013
Valkude reaktsioonid
Valgud on polüpeptiidid, mis koosnevad omavahel peptiidsidemega seotud aminohapetest. Valkudes sisalduvaid aminohappeid on 20 ning nad erinevad üksteisest radikaalide struktuuri poolest. Valkude primaarne struktuur iseloomustab aminohapete valikulist järjekorda, sekundaarne struktuur polüpeptiidahela üksikute lõikude korda ja tertsiaarne struktuur kogu valgumolekuli ruumilisust. Kui molekul koosneb enam kui ühest polupeptiidahelast(subühikutest) moodustuvad oligomeersed valgud, mis omavad ka kvaternaarset struktuuri. Ruumilised struktuurid on fikseeritud nõrkade keemiliste sidemete ja vastasmõjudega. Kui valgu ruumilises struktuuris grupeeruvad ümber ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgad sidemed, aga säilivad aminohappeid ühendavad peptiidsidemed, siis sellist lagunemist nimetatakse denaturatsiooniks. Peptiidsidemete lagunemine on valgu hüdrolüüs.
Valkude kindlakstegemiseks lahustes või bioloogilistes vedelikes ja ka nende aminohappelise koostise iseloomustamiseks kasutatakse värvusereaktsioone, , valkude eraldamiseks madalama molekulmassiga peptiididest, denaturatsiooni protsessi uurimiseks ning erinevate valgusfraktsioonide lahustamiseks kasutatakse mitmeid sadestamismeetodeid. Kvalitatiivseid reaktsioone on kahte tüüpi: Universaalsed ehk üldreaktsioonid, mis on omased kõikidele valkudele ja spetsiifilised ehk erireaktsioonid , mis on iseloomulikud ainult teatud aminohapetele valgu molekulis või vastavas lahuses.

Biureedireaktsioon
Biureedireaktsioon on üldreaktsioon, mida annavad kõik ained, mis sisaldavad vähemalt kahte peptiidsidet. Leeliselises kekskonnas annab valk vask(II)ioonidega sinakasvioletse värvuse, peptiidid aga roosa värvusega biureetkompleksi, mis moodustub vase ioonide seostumisel peptiidsidemete koostises oleva 4 lämmastiku aatomiga. Värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses.
Töö käik: Katseklaasi valatakse 1ml munavalgu lahust. Lisatakse 1ml 10%-list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust, loksutatakse, mille pärast lahus värvub violetseks.
Järeldus: Lahus andis violetse värvuse, sest esineb leeliseline keskkond, mida põhjustas NaOH lisamine lahusele. Pärast lisamist CuSO4, vaskioonid (Cu2+) seostuvad peptiidsideme koostises olevate lämmastiku aatomitega, andes violetse biureetkompleksi. Sellest järeldub, et lahuses on peptiidsidemed ja katses oli kasutusel tõesti munavalk .

Mulderi reaktsioon .
Reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete olemasolu. Kontsentreeritud HNO3 lisamisel sadestub valk ja soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine.
Töö käik: Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust ja lisatakse 5 tilka kontsentreeritud HNO3. Loksutatakse ja soojendatakse, mille tõttu valge sade värvub kollaseks. Seejärel jahutatakse segu ja lisatakse NH4OH lahust ja loksutatakse. Lahus värvus tumekollaseks.
Järeldus: Kui soojendada reaktsioonisegu, toimub aromaatsete tuumade nitreerimine ja moodustub nitrofenooli tüüpi ühend, mille värvus on kollane. Kui lisada NH4OH lahust, käitub nitrofenool leeliselises keskkonnas kui hape (indikaatorina) ja lahus värvub oranziks. Minu katses ei värvunud oranziks ja viga võib olla väheses soojendamises või liiga väikeses NH4OH koguses.

Milloni reaktsioon
Kasutatakse elavhõbe(II) nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga ehk Milloni reaktiivi. Milloni reaktiiviga reageerivad aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped .
Töö käik: Võetakse 2 katseklaasi, ühte valatakse 1ml munavalgu lahust, teise 1ml zelatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisatakse 6 tilka Milloni reaktiivi. Munavalgu lahuses moodustus valge sade. Mõlemaid katseklaasi soojendatakse. Munavalgu lahus värvus roosakas-punaseks, aga zelatiini lahus jäi muutumatuks.
Järeldus: Munavalk andis positiivse Milloni reaktsiooni, mis on seotud sellega, et munavalgu lahus sisaldab aromaatsest tuuma sisaldavat aminohapet (Tyr). Aga zelatiin jäi muutumatuks, kuna zelatiin ei sisalda aromaatset tuuma omavaid aminohappeid.

Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon
Sulfhüdrüülrühmad valkudes ja aminohapetes alluvad hõlpsasti leeliselisele hüdrolüüsile ja annavad sulfiidioonne. Pb2+ juuresolekul tekib mustjas ülipeen pliisulfiid sade. Reaktsioon näitab tsüsteiini (Cys) olemasolu valgus.
Töö käik: 2ml Pb( CH3COO )2 0,5%-lisele lahusele lisatakse tilgakaupa 10%-list NaOH lahust kuni tekkiv Pb(OH)2 sade kaob. Lisatakse katseklaasi 1ml munavalgu lahust, loksutatakse ja soojendatakse mõne minuti vältel. Lahus värvus pruuniks . Seejärel asetame katseklaasi statiiivi, et sademe moodustumine jätkuks. Tekkis tumepruun- mustjas sade.
Järeldus: Tegemist on positiivse sulfhüdrüülreaktsiooniga, mis tähendab, et valgus on tsüsteiin (Cys). Pruun värvus on seotud sellega, et sulfiidioonid (tekkisid leeliselise hüdrolüüsi tõttu) reageerisid Pb2+ ioonidega.
CH2–SH CH2OH
I I
HC–NH2 + 2NaOH + H2O → HC–NH2 + Na2S + H2O
I I
COOH COOH
Na2S + Na2PbO2 + 2H2O → PbS↓ + 4NaOH

Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroäädikhapet kasutatakse valkude eraldamiseks madalmolekulaarsetest lämmastikuühenditest. Laialdaselt levinud valke väljasadestav reagent, kuid ei sadesta peptiide, mille molekulmass on alla 10 000.
Töö käik: Katseklaasi valatakse 1ml munavalgu lahust ja lisatakse mõni tilk CCl3COOH lahust. Lokutades tekib valge lendlev sade.
Järeldus: Valgu sade tekkis, sest valk denatureeris. Toimus valgu eraldamine valgu hüdrolüüsi produktidest. See tähendab, et valgu molekulmass, mida katses kasutati on üle 10000.
1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Väljasoolastumist põhjustab neutraalsete soolade kõrgetest konsentratsioonidest tingitud valkude pöördumatu denaturatsioon. Sadestumise protsessi mõjutavateks teguriteks on hüdrofiilsus, laeng, molekulmass jne.
Töö käik: 2ml munavalgu lahusele lisatakse 2ml (NH4) 2SO4 küllastunud lahust, loksutatakse ja jäetakse 5min seisma. Tekkis globuliinide sade, millest ½ filtreeritakse. Saadud filtraadile lisatakse kristalset (NH4)2SO4 kuni küllastuskontsentratsiooni saavutamiseni. Moodustus albumiinide sade, mille võrdlemisel globuliinide sademega võime järeldada, et globuliinide hulk on suurem.
Järeldus: Globuliinid sadestuvad poolküllastunud lahuses, kuid albumiinid küllastunud lahuses. Küllastunud lahuses tekkis suuremal hulgal sadet kui poolküllastunud lahuses, seega on munavalgus albumiinide rohkem albumiine kui globuliine.
1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Kõrgel temperatuuril denatureeruvad kõik valgud, kuid vastav temperatuur oleneb valgu loomusest ja keskkonna koostisest. Enamasti kaasneb denatureerumisega valgu väljasadestumine lahusest, kuid pH väärtuse oluline erinemine isoeletrilisest täpist(pl) kõrvaldab väljasadestumise.
Töö käik: Kahte katseklaasi valatakse 2ml munavalgu lahust. Ühte katseklaasi lisatakse 1ml kontsentreeritud äädikhapet. Katseklaase kuumutatakse keeval vesivannil . Ainult munavalgu lahus muutus kergelt häguseks, kuid äädikhappe ning munavalgu lahusel muutusi näha ei olnud.
Järeldus: Valku denatureerimine sõltub temperatuurist ja pH-st. Katses me näeme, et happelises keskkonnas (pH