Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega (0)

Laboratoorne töö I
Üliõpilane: Meelika Lukner (155308)
Kuupäev: 12.02. 2016
Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega
Kvalitatiivsed reaktsioonid võimaldavad kindlaks teha mingi aine või ühendite rühma olemasolu (või ka puudumist) uuritavas materjalis. Saadav informatsioon on kas ei või jah, seega ei mõõdeta komponendi kvantitatiivset sisaldust.
Kuna kvalitatiivne analüüs ei nõua reagentide täpseid doose, siis mainin siinkohal ära, et kõik uuritavate proovide ja reagentide doosid võetakse ligikaudse täpsusega.
1.1.Valkude reaktsioonid
Valgud on polüpeptiidid, mis on omavahel seotud amiidsidemetega. Nende koostises leidub 20 üldlevinud aminohapet.
[ https://www.neb.com/~/media/NebUs/Page%20Images/Tools%20and%20Resources/Usage%20Guidelines/aminoAcids.jpg ]
Valgud täidavad oma funktsioone, mis tulenevad erinevatest struktuuridest. Primaarstruktuur on seotud omavahel kovalentsete sidemetega, kõrgemad struktuurid nõrkade sidemete ja vastasmõjudega.
Ruumilise struktuuri lagunemist nimetatakse denaturatsiooniks, mille tagajärjel katkevad nõrgad sidemed (peptiidsidemed säilivad). Denatureerimise tagajärjel võib väheneda valgu lahustuvus ning see võib lahusest välja sadeneda. Peptiidsideme katkemisel on tegu hüdrolüüsiga.
Valkude kvalitatiivseid reaktsioone on kahte tüüpi: universaalsed ehk üldreaktsioonid, mis on omased kõikidele valkudele ja spetsiifilised ehk erireaktsioonid , mis on iseloomulikud ainult teatud aminohappeid sisaldavatele valkudele.
Töövahendid

• Katseklaasid
  
• Elektripliit
  
• Keeduklaas vesivanni tarbeks
  
• Plastiklehter, filterpaber
  
• Munavalgu lahus
  
• Reaktiivid erinevate reaktsioonide läbiviimiseks
  

1.1.1. Biureedireaktsioon
Tegemist on valkude üldreaktsiooniga, mille tulemusel moodustavad kaht või enamat peptiidsidet omavad valgud aluselises keskkonnas vask(II) ioonidega violetse kompleksi.
Töö käik
Valan katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, lisan 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust. Loksutan katseklaasi hoolikalt.
Järeldus
Lahus värvub violetseks, seega sisaldab munavalgu lahus vähemalt kahte peptiidsidet.
1.1.2.Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon )
Ksantoproteiinreaktsioon tõestab aromaatse tuuma olemasolu. Lahuse nitreerimise tagajärjel denatureerub valk pöördumatult ja sadestub. Moodustunud nitrofenooli tüüpi ühend annab kollase värvuse ja käitub hape /alus indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas oranži värvuse.
Töö käik
Valan katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, lisan 5-6 tilka kontsentreeritud HNO3, loksutan ja soojendan, kuni sade värvub kollaseks. Seejärel jahutan segu ja lisan NH4OH lahust ja loksutan lahust.
Järeldus
Lahus värvus küll kollaseks, mis tõestab aromaatset tuuma, kuid ammooniumhüdroksiidi lisamisel ei värvunud oranžiks. Selle põhjuseks võis olla vähene ammooniumhüdroksiidi lisamine, mille tagajärjel ei tekkinud piisavalt aluseline keskkond.
1.1.3.Milloni reaktsioon
Milloni reaktiiviga (elavhõbe(II) nitraadi lahus lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga) reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid (türosiini radikaalid). Positiivse Milloni reaktsiooni korral värvub lahus või denatureerunud valgu sade roosakaks kuni telliskivipunaseks.
Töö käik
Valan ühte katseklaasi 1 ml munavalgu lahust ja teise 1 ml želatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisan 5-6 tilka Milloni reaktiivi ja soojendan segu 40-50oC-ni.
Järeldus
Munavalgu lahuses tekkis paksem roosakas sade, seega sadestus denatureerunud türosiin välja. Želatiini lahus värvus roosakaks, türosiin ei sadestunud välja. Türosiini olemasolu on tõestatud.
1.1.4.Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon
Positiivne sulfhüdrüülreaktsioon näitab tsüsteiini esinemist valgus. Tsüsteiini radiikaalis leiduv tioolrühm allub leeliselisele hüdrolüüsile ja annab sulfiidioone. Plii(II) ioonide juuresolekul moodustub PBS sade, mis on musta või tumepruuni värvi.
Töö käik
2 ml Pb( CH3COO )2 0,5%-lisele lahusele lisan tilgakaupa 10%-list NaOH, kuni tekkiv Pb(OH)2 sade kaob ja moodustub Na2PbO2. Lisan 1 ml munavalgu lahust, loksutan ja soojendan reaktsioonisegu, kuni tekib pruunikasmust sade.
Järeldus
Soojendamise järel tekkis katseklaasi kenasti pruunikasmust sade. Tsüsteiini olemasolu on tõestatud.
1.1.5.Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroetaanhape on valke denatureeriv ja väljasadestav, kuid ei sadesta peptiide, mille molekulmass on alla 10 000.
Töö käik
Valan katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, lisan paar tilka CCl3COOH lahust ja loksutan hoolikalt.
Järeldus
Tekkis valge piimjas sade, st lahusest sadestusid välja denatureerunud valgud. Reaktsiooni alusel võib arvata, et peptiidide molekulmass on vähemalt 10 000.
1.1.6.Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Neutraalsete soolade kõrged kontsentratsioonid põhjustavad valkude pöörduvat denaturatsiooni . Globuliinid sadestuvad (NH4) 2SO4 poolküllastunud lahuses, albumiinid aga küllastunud lahuses.
Töö käik
Lisan 2 ml munavalgu lahusele 2 ml (NH4)2SO4 küllastunud lahust, loksutan ja jätan 5 minutiks seisma. Katseklaasi tekib valge sade, mis filtritakse . Seejärel lisatakse filtraadile kirstalset (NH4)2SO4 kuni lahus muutub küllastunuks.
Järeldus
Soola lahuse lisamisel tekkis katseklaasi valge sade, milleks olid väljasoolastatud globuliinid. Kristalse soola lisamisel tekkis uuesti valge sade, milleks olid seekord väljasoolastatud albumiinid.
1.1.7.Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Valgud denatureeruvad kõrgetel temperatuuridel pöördumatult ning sadenevad lahusest välja. Kui keskkonna pH erineb tunduvalt valgu isoelektrilise täpi (pI) väärtusest, siis ei sadestu denatureerunud valk lahusest välja.
Valgu pI näitab keskkonna pH väärtust, mille juures võrdub valgumolekuli summaarne laeng nulliga. Sellest tingituna agregeeruvad valgumolekulid ning sadestuvad lahusest välja. Madalama pH-ga keskkonnas omandavad kõik valgumolekulid ühesuguse laengu ning valk-valk interaktsioonide lakkamisel väljasadestumist ei toimu.
Töö käik
Valan 2 ml munavalgu lahust kahte katseklaasi. Ühte neist lisan 1 ml kontsentreeritud äädikhapet. Kuumutan katseklaase keeval vesivannil.
Järeldus
Äädikhappeta lahusesse tekkis valge sade, seega valgud sadestusid kõrge temperatuuri mõjul lahuses välja.
Äädikhappega lahus jäi samasuguseks ka pärast kuumutamist, seega pH alandamine tingis valkude mitteväljasadestumise.
1.1.8.Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega
Orgaanilised lahused tingivad aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise molekulide välispinnale (hüdrofoobsed „pead“ pööravad end ringi), mille tagajärjel valk dehüdratiseerub ja sadestub lahusest välja. Vee lisamisel lahustub tekkinud sade, va juhul, kui orgaanilist solventi lisatakse suures koguses, mis põhjustab valgu pöördumatu denaturatsiooni. Sellisel juhul ei lahustu sade enam täielikult.
Töö käik
Valan katseklaasi 2 ml munavalgu lahust ja lisan tilgakaupa atsetooni . Sademe tekkimisel lahjendan katseklaasi sisu veega.
Järeldus
Atsetooni lisamisel tekkis katseklaasi valge sade, mis näitab, et valk denatureerus. Vee lisamisel sade lahustus, mis tähendab, et tegemist oli pöörduva denaturatsiooniga (toimus renaturatsioon ).
1.2.Süsivesikute reaktsioonid
Süsivesikud koosnevad süsinikest, vesinikest ja hapnikutest. Struktuuriliselt jaotatakse neid mono -, oligo - ja polüsahhariidideks. Monosahhariidid on oligo- ja polüsahhariidide „ehituskivideks“. Oligosahhariidid koosnevad mõnest monosahhariidi molekuli jäägist, aga polüsahhariidid on sajad või tuhanded lihtsuhkru molekuliahelad. Vastavat poolketaalse hüdroksüülrühma esinemise või puudumise järgi jaotatakse oligosahhariide redutseerivateks ja mitteredutseerivateks.
Oligo- ja polüsahhariidi monomeerid on seotud O-glükosiidsidemega.
Enamus kvalitatiivsed reaktsioonid baseeruvad karbonüülrühma esinemisele molekulis. Leeliselises keskkonnas redutseerivad suhkrud oksüdeerijaid. Neutraalses ja happelises keskkonnas toimub oksüdatsioon ilma molekuli destruktsioonita ja produktideks on erinevad happed .
Lisaks põhineb üks analüüsi meetoditest veel heterotsükliliste aldehüüdide furfuraali moodustumisele süsivesikute kuumutamisel tugeva mineraalhappe juuresolekul.
[ http://blog.canacad.ac.jp/wpmu/15matser/files/2011/08/anatomy-carbohydrates.jpg ]
Töövahendid

• Katseklaasid
  
• Elektripliit
  
• Keeduklaas vesivanniks
  
• Erinevad süsivesikute lahused
  
• Reaktiivid erinevate reaktsioonide läbiviimiseks
  

1.2.1.Molisch’i test
Tegemist on süsivesikute kvalitatiivse analüüsi põhitest. Tugevas happelises keskkonnas toimub monosahhariidide vabanemine . Väävelhappe toimel suhkrud dehüdreeruvad ja moodustavad furfuraale või 5-hüdroksümetüülfurfuraale. Need produktid reageerivad edasi α-naftooliga, moodustades purpurselt värvunud kihi ja happe kihi.
Töö käik
Valan ühte katseklaasi 2 ml tärklise lahust ja 2 ml sahharoosi lahust. Lisan mõlemasse 5-6 tilka Molischi reaktiivi. Loksutan hoolikalt. Lisan ettevaatlikult tilkhaaval kontsentreeritud väävelhapet nii, et hape voolaks mööda katseklaasi külge selle põhja uuritava lahuse alla. Katseklaasi ei tohi loksutada .
Järeldus
Mõlemasse katseklaasi moodustus eraldi happekiht põhja ning happe ja lahuse piirile tekkis violetne kondentsatsiooniprodukt. Järelikult toimus furfuraalide moodustumine.
1.2.2.Osasoonide saamine
Osasoonid on süsivesikute derivaadid , mis tekivad taandava suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga. Nad kristalluvad lahusest välja ning kristallide kuju ja sulamistemperatuur on lähtesuhkrule iseloomulikud.
Töö käik
Valan ühte katseklaasi 2 ml glükoosi ja teise 2 ml laktoosi. Mõlemasse lisan 0,1 g fenüülhüdrasiini ja 0,2 g kristallilist naatriumatsetaati. Loksutan ainete lahustumiseni. Hoian reaktsioonisegu 40 minutit keevas veevannis ning seejärel jahutan jäävannis. Katseklaasidesse moodustuvad suhkrute osasoonid.
Järeldus
Laktoosi osasoonid tekkisid kiiremini ja olid silmaga paremini nähtavad, kuna tegemist on oligosahhariidiga. Glükoosi osasoonid tekkisid alles pärast jäävannis hoidmist ning kristallid olid tunduvalt pisemad ning halvemini märgatavad, sest tegemist on monosahhariidiga.
http://www.didier-pol.net/glucx250.jpg
http://www.didier-pol.net/lactx160.jpg
1.2.3.Hõbepeegli reaktsioon
Taandavates suhkrutes sisalduv aldehüüdrühm taandab metallide sooli . Ammoniakaalsest hõbenitraadi lahsest sadestub metalliline hõbe välja ning katseklaasi pinnale moodustub peegel .
Töö käik
Valan katseklaasi 1 ml 1%-list AgNO3 lahust, lisan 0,5 ml kontsentreeritud NH4OH lahust ja loksutan. Seejärel lisan 1 ml glükoosi lahust, loksutan ja soojendan ettevaatlikult veevannis. Määrdunud katseklaasi kasutamisel , ettevaatamatul soojendamisel või reaktiivide koguste liialdamisel tekib tumehall või must sade ja peeglit ei teki.
Järeldus
Esialgselt tekkis tumehall sade ning arvasin, et hõbepeegel ei tule välja, kuid otsustasin natukene rohkem lahust soojendada (proovisin esialgselt vältida ettevaatamatut soojendamist). Seejärel tekkis hõbepeegel katseklaasi põhja ning kergelt ka seintele . Võib-olla oleksin pidanud rohkem soojendama, et reaktsioon paremini välja kukuks, kuid katse tõestas, et suhkur sisaldab aldehüüdrühma.
1.2.4.Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega
Taandavate suhkrute määramisel on üheks levinumaks reaktiiviks Fehlingi reaktiiv ( leeliseline vask(II)tartraatkompleks). Tekkiv vask(II)tartraatkompleks reageerib aldooside või ketoosidega. Vaba aldehüüd-või ketorühma toimel vask taandub, mis vask(I)oksiidina lahusest välja sadestub (punane sade). Suhkur oksüdeerub aga happeks . Taandavad suhkrud annavad positiivse reaktsiooni, sahharoos aga pole taandav. Küll aga hüdrolüüsub sahharoos hapendamisel glükoosiks ja fruktoosiks, mis annavad positiivse tulemuse.
Töö käik
Võtan kaks katseklaasi ja lisan kummasegi 1 ml sahharoosi lahust. Ühte neist lisan 1 tilka kontsentreeritud HCl. Loksutan ja hoian mõlemat lahust 5 minutit veevannis 80-85oC juures. Seejärel lisan mõlemasse katseklaasi 1 ml Fehling I (CuSO4 (aq)) ja Fehling II (leeliseline Seignett’i soola lahus (aq)) lahust ja loksutan hoolikalt. Mõlemas katseklaasis tekib intensiivne sinine värvus. Soojendan uuesti.
Järeldus
Sahharoosi lahusesse, millele lisasin soolhapet, tekkis punane sade. Järelikult toimus selles lahuses edukalt sahharoosi hüdrolüüs glükoosiks ja fruktoosiks, mis andis katsele positiivse tulemuse.
1.2.5.Barfoed’i reaktsioon
Reaktsioon võimaldab eristada taandavaid monosahhariide oligosahhariididest, kuna nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske ainult monosahhariidid. Sarnaselt Fehlingi reaktiiviga peaks tekkima punane vask(I)oksiidi sade.
Töö käik
Võtan kaks katseklaasi ning valan ühte 1 ml glükoosi ja teise 1 ml laktoosi lahust. Lisan mõlemale 3 ml Barfoed’ reaktiivi (vask(II)atsetaadi lahus äädikhappes), segan hoolikalt ja hoian kuumal veevannil 5 minutit.
Järeldus
Glükoosi lahuses tekkis punane sade. Laktoosi lahus ei muutunud. Järelikult on reaktsioon tõestanud monosahhariidi lahuse.
1.2.6. Selivanoff ’i reaktsioon
Suhkrute kuumutamisel tugevate mineraalhapete juuresolekul moodustub kas furfuraal või 5-metoksümetüülfurfuraal. Need reageerivad mitemaluseliste fenoolidega, mille tulemiks on värvilised produktid.
Töö käik
Võtan kaks katseklaasi ning valan ühte 1 ml fruktoosi lahust ja teise 1 ml glükoosi lahust. Lisan 2 ml Selivanoff’i reaktiivi, loksutan ja soojendan 4-5 minutit keeval veevannil.
Järeldus
Fruktoosi lahus värvub juba paari minuti möödudes telliskivipunaseks. Glükoosi lahus värvub kollakaks. Mõlemas lahuses moodustusid furfuraalid.
1.2.7.Tärklise reaktsioon joodiga
Polüsahhariidide ahelad keerduvad joodi molekulide ümber ning selle tulemusel tekivad lillakas -sinised kompleksid . Kõrgemal temperatuuril kompleks laguneb ja kaotab värvuse.
Töö käik
A.Valan katseklaasi 4-5 ml tärkliselahust ja lisan 1 tilga joodilahust. Loksutan segu ja kuumutan keemiseni. Seejärel jahutan katseklaasi veejoa all.
Järeldus
Joodilahuse lisamisel värvus lahus tumesiniseks, kuna tekkis kompleksühend. Kuumutamisel kompleks laguneb ja lahus muutus värvituks. Külma veejoa all jahutades moodustus kompleks uuesti ning lahus värvus uuesti tumesiniseks. Reaktsioon tõestas edukalt polüsahhariide.
B. Vaatlesime mikroskoobi all kartuli- ja maisitärklist ning glükoosi, maltoosi ja laktoosi.
Kartulitärklise graanulid on suuremad, ümmargusemad ja omavahel rohkem koos, aga maisitärklise graanulid on seevastu pisemad, lopergusemad ning osakesed on üksteise küljes endid „grupeerinud“.
1)Kartulitärklis
[ http://www.visualphotos.com/photo/1x5664899/potato-starch-through-microscope.jpg ]
2)Maisitärklis
[ http://clarissacagnato.weebly.com/uploads/1/4/4/5/14451102/7938612_orig.jpg?365 ]