Biokeemia praktikum Valkude ja süsivesikute reaktsioonid (1)

Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö nr.1.1 ja 1.2
Anna Logunova
YAGB-22
Valkude reaktsioonid
Valgud -polüpeptiidid,milles „ehituskivideks“ olevaid aminohapped on omavahel seotud amiidsidemete abil (peptiidsidemete abil).Peptiidside moodustub ühe aminohappe karboksüülrühma reageerimisel teise aminohappe aminorühmaga.Peptiidside on planaarne ning enamasti trans-konformatsioonis.Valkude kostises leidub 20 üldlevinud aminohapet( proteogeensed).Valgud täidavad oma funktsiooni tänu nende iseloomulikele ruumilistele struktuuridele(primaarne, sekundaarne ,tertsiaalne ja kvaternaarne).
Denaturatsioon -valgu unikaalse ruumilise struktuuri lagunemine (peptiidsisemed ei katke ja primaar struktuur säilib).
Valkude reaktsioonide tüübid:

• Kvantitatiivsed reaktsioonid(värvusreaktsioonid,väljasadestamine,väljasoolastamine)
  
• Kvalitatiivsed reaktsioonid
  

Kvalitatiivseid reaktsioone on kahte tüüpi:

• Universaalsed (üldreaktsioonid),nt. biureedireaktsioon .Nad on omased kõikidele valkudele .
  
• Spetsiifilised( erireaktsioonid ),nt.tiooli-, ksantoproteiini -,Milloni reaktsioon .Nad on iseloomulikus ainult teatus aminohappeid sisaldavatele valkudele.
  

1.Biureedireaktsioon
Ühendid, mis sisaldavad kaht või enamat peptiidsidet, moodustavad aluselises keskkonnas Cu2+-ioonidega violetse kompleksi. Test on oma nimetuse saanud uurea derivaadi biureedi järgi, mis annab Cu2+-ioonidega tüüpilise positiivse reaktsiooni.
Kuna biureedireaktsioon on tingitud peptiidsidemete esinemisest, siis on ta valkude üldreaktsioon. Leeliselises keskkonnas moodustavad Cu2+- ioonid valgumolekulidega sinakasvioletse, lühikese ahelaga peptiididega (valgu hüdrolüüsi produktidega) aga roosa värvusega biureetkompleksi. Kompleksi värvus on tingitud Cu2+-ioonide koordinatiivsest seostumisest nelja peptiidsidemete koostisse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses.
Vaadake uuest juhendist katse teooriat. Biureet ei moodustu ainult peptiidsideme hapnikutega.
Töö käik:
Katseklaasi valan 1 ml munavalgu lahust. Lisan 1 ml 10% NaOH , mõni tilk 1% CuSO4 lahust ja loksutan.
Tulemus:
Pärast ainete segamist lahuse värmus muutus violetseks.See tähendab ,et lahusel on aluseline keskkond,lahus sisaldab valku,mis koosneb rohkem,kui kahest peptiidsidemest.
2.Ksantoproteiinreaktsioon(Mulderi reaktsioon)
Mulderi reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete(Tyr,Trp,Phe) olemasolu valgus.Kontsentreeritud lämmastikhape lisamisel valk denatureerub pöördumatult ja sadestub.Soojendamisel toimub aromatsete tuumade nitreerumine.Moodustub nitrofenooli tüüpi ühend,mis on intensiivse kollase värvusega,käitub hape /alus indikaatorina,omandades aluselis keskkonnas oranzi värvuse.
OH OH O
Töö käik:
Katseklaasi valan 1 ml munavalgu lahust. Lisan 5-6 tilka kontsentreeritud HNO3 , soojendan reaktsioonisegu. Seejärel jahutan segu, lisan NH4OH kuni ammoniaagi lõhn ilmub.
Tulemus:
Pärast munavalgu ja kontsentreeritud lämmastikhape segamist tekkis valge sade,see tähendab seda,et valk denatureeris ja sadestus. Mis veel valguga juhtus? Soojendamise ajal lahuse värvus muutus kollaseks,toimus aromaatsete tuumade nitreerimine. Mille nitreerimine? Kui lisasin ammoniaagi lahust,siis tekkis kaks kihti.Ülemine kiht on kollane ja mitteläbipaistev,ta on leeliseline ,alumine kiht on helekollane,ta on happeline.Moodustub nitrofenooli tüüpi ühend,mille värvus on helekollane.Pärast NH4OH lisamist, nitrofenool käitus leeliselis keskkonnas kui hape ja lahus värvus kollaseks.Miks teil kaks kihti tekkisid? Katseklaasis tekkisid kaks kihti ,sest osa lahusest on happeline ja osa lahusest on aluseline,nad teine teisega ei segu.
Järeldus:Lahuses olid valgud,mille koostises on aromaatse tuumaga aminohapped.
3.Milloni reaktsioon
Reaktsioonis kasutatakse Milloni reaktiivi,mis koosneb elavhõbe(ll) nitraadi lahust lämmastikhappes vähese
lisandiga.Milloni reaktiviga reageerivad fenoolset rühma sisaldavad ühendid,valkude puhul türosiini radikaalid. Milloni reaktiiviga annab valk soojendamisel tugevalt intensiivset punaka sademe.
OH O
OHg
HNO3 +Hg NO3 O2N N O
+ 2H2O
värvitu punakas
Töö käik:
Ühte katseklaasi valan 1 ml munavalgu lahust, teise 1 ml želatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisan 5-6 tilka Milloni reaktiivi (Hg(NO3)2 + HNO3). Soojendan reaktsioonisegu 40-50 ºC-ni.
Tulemus:
Esimeses katseklaasis munavalgu lahusega,soojendamise ajal tekkis tahke valge sade , millest ei saa türosiinide järeldada.Aga peaks tekima roosakas -punane sade,sest türosiinide sisaldust näitab roosakas-punane sade.Siit võin järeldada ,et mul see katse ebaõnnestus ja tekkis vale tulemus..Teises katseklaasis zelatiiniga,soojendamise ajal sadet ei ole tekkinud .
Järeldus:Katse tõestab aromaatset tuuma sisaldust munavalgu lahuses ning seda, et želatiinis aromaatset tuuma ei ole,sest lahus jäi muutumatuks.Munavalgu lahus sisaldas aromaatset tuuma sisaldavat aminohapet (Tyr,esineb enamiku valkude koostises). Kuidas te saate järeldada, et munavalgus on türosiine, kui katse tulemus on teil valge sade? Türosiinide sisaldust näitab roosakas/punane sade. Teie katses tekkis valge sade, millest ei saa türosiinide sisaldumist järedada.
4.Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon
Sulfhüdrüülrühmad (-SH) valkudes ja aminohapetes alluvad hõlpsasti leeliselisele hüdrolüüsile, andes sulfiidioone. Pb++ juuresolekul tekib kuumutamisel must või tumepruun ülipeen pliisulfiidi sade. Katse teostatakse naatriumplumbaadi(ΙΙ) lahusega.
CH2 SH +H2O CH2 OH
HC NH2 + 2NaOH HC NH2 + Na2S + H2O
COOH COOH
Na2S + Na2PbO2 + 2 H2O PbS + 4 NaOH
Töö käik:
1 ml Pb( CH3COO )2 0,5% lahusele lisan tilgikaupa 10% NaOH kuni tekkiv sade lahustub. Kust te 20% NaOH lahuse saite? Meil on laboris kasutusel ainult 10% NaOH. Lisan 0,5 ml munavalgu lahust. Keedan reaktsioonisegu mõne minuti vältel pruunikasmusta kolloidse sademe tekkimiseni.
Tulemus:
Pärast ainete segamist ja kuumutamist lahuse värvus muutus tumepruuniks,aga sadet ei tekkinud.Katse ebaõnnestus,sest keskkond oli liiga leeliseline.
5.Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroäädikhape on valke denatureeriv ja lahusest väljasadestav reagent ,kuid ta ei sadesta peptiide,mille molekulmass on alla 10000.Trikloroäädikhapet saab kasutada valkude eraldamiseks madalmolelaarsetest lämmastikuühenditest.
Töö käik:
Katseklaasi valan 1 ml munavalgu lahust ja lisan mõni tilk CCl3COOH lahust. Loksutan.
Tulemus:
Katseklaasis toimus valgu denaturatsioon ja siis valk sadestus.Toimus valgu eraldumine madalmolekulaarsetest lämmastikühenditest.See tulemus näitab,et lahuses olevate peptiide molekularmass on suurem,kui 10000. Mis toimus valguga veel peale denaturatsiooni ? Enne toimub denaturatsioon ja siis sadenemine.
6.Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Neutraalsede soolade kõrged kontsentratsioonid põhjustavadvalkude pöörduvat denaturatsiooni,millega kaasneb väljasedestumine lahusest(väljasoolastamine).Globuliinid sadestuvad (NH4) 2SO4 poolküllastunud lahuses.Albumiinid sadestuvad soola küllastunud lahuses.
Töö käik:
2 ml munavalgu lahusele lisan võrdne hulk küllastunud (NH4)2SO4 lahust ja jättan 5 minutiks seisma. Globuliinide sade eraldan filtrimisel . Filtraadile lisan küllastumiseni kristalset (NH4)2SO4 .
Tulemus:
Pärast ainete segamist lahuses tekkis valge sade.Kui lisasin filtraadile kristalset(NH4)2SO4 tekkis natuke rohkem sadet,kui esialgselt. Mida saate siit globiliinide ja albumiinide kohta järeldada?
Järeldus: Valkude sadestumist sooladega mõjutavad erinevad faktorid : globuliinid sadestusid poolküllastunud lahuses,albumiinid sadestusid sama soola küllastatud lahuses.
7.Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Kõik valgud denatureeruvad kõrgel tempereatuuril pöördumatult,kuna ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgad sidemed katkevad . Denatureerumise temperatuur sõltub valgust ja keskkonna koostisest.Denatureerimisega kaasneb valgu väljasadestumine lahusest.Kui aga keskkonna pH väärtus erineb tunduvalt valgu isoelektrilise täpi (pl) väärtusest,siis ei pruugi denatureerunud valk lahusest välja ei sadestuda.Valgu pl näitab keskkonna pH väärtust,mille juures valgumolekulis on positiivse ja negatiivsete laengute hulk võrdne,seega summarne laeng võrdub nulliga.
Töö käik:
Kahte katseklaasi valan 2 ml munavalgu lahust. Ühte katseklaasi lisan 1 ml kontsentreeritud äädikhapet. Mõlemaid lahuseid kuumutan keemiseni.
Tulemus:
Esimeses katseklaasis,kus oli munavalk ja kontsentreeritud äädikhape ,lahus ei muutu,sade ei tekkinud.Teises katseklaasis,kus oli munavalk,tekkis valge sade.See tähendab,et valk denatureeris. Esimeses katseklaasis erinevus valgu pI ja pH vahel on suur ja denatureerunud valk jääb lahusesse.
8.Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega
Veega segunevaid orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise molekulide välispinnale.toimub valgu dehüdreerumine,mistõttu valk sadestub lahusest välja. Sadesti kontsentratsiooni vähenemisel lahustub sade uuesti.
Töö käik:
Katseklaasi valan 2 ml munavalgu lahust.Loksutan segu pidevalt, lisan orgaanilist solventi kuni sade tekkib . Seejärel segu lisan vesi kuni sade lahustub.
Tulemus:
Alguses lahus oli läbipaistev,pärast solvendi lisamist tekkis valge sade,toimus valgu dehüdratiseerumine.Kui lisasin lahusele vesi sade lahustus,järelduseks võin öelda,et tegemist on pöörduva denaturatsiooniga.
Süsivesikute reaktsioonid
Süsivesikud-bioloogiliste ühendite rühm,mis koosneb ainult süsinikust,vesinikustja hapnikust.Vastavalt sruktuurile neid jaotatakse mono -, oligo -ja polüsahhariidideks. molekuli üldvalem, kuid nendel on erinevad stereostruktuurid ja ehitus: polühüdroksüaldehüüdid või ketoonid , lineaarsed või tsüklilised, viie- või kuueliikmelised tsüklid.
Oligosahhariidid – koosnevad mõnest monosahhariidi molekuli jäägist.
Polüsahhariidid – suur arv lihtsuhkru molekule ühinenud pikkadeks sirgeteks või hargnenud struktuuriga ahelateks.
Vastavalt vaba aldehüüdrühma esinemisele molekulis jaotakse suhkrud redutseerivateks (taandavateks) ja mitteredutseerivateks (mittetaandavateks).
Paljude süsivesikute kvalitatiivsete reaktsioonide aluseks on nende redutseerimisvõime. Leeliselises keskkonnas redutseerivad suhkrud metallide ioone ja teisi oksüdeerijaid, kusjuures reeglina suhkru molekuli süsinikuahel reaktsiooni käigus laguneb ning tekib mitmete oksüdatsiooniproduktide segu. Happelises või neutraalses keskkonnas toimub suhkrute oksüdatsioon ilma molekuli destruktsioonita.
Teine osa meetoditest põhineb heterotsükliliste aldehüüdide moodustumisel süsivesikute kuumutamisel.
1.Molisch’I test
Molisch’i testi võib lugeda süsivesikute kvalitatiivse analüüsi põhitestiks,kuna positiivse reaktsiooni annavad nii mono-,oligo- kui polüsahhariidid. . Süsivesikute olemasolu korral tekib nende segus α-naftooliga (C10H7OH) kontsentreeritud väävelhappe lisamisel happe ja uuritava lahuse piirpinnale purpurne vahekiht .
Töö käik:
Katseklaasidesse valan 1,5 ml uuritavat süsivesiku lahust. Igasse katseklaasi lisan3-4 tilka Molischi reaktiivi ja segan hoolikalt. Kaldu asetatud katseklaasi lisan ettevaatlikult tilkhaaval 1 ml kontsentreeritud väävelhapet.
Tulemus:
Esimeses katseklaasis oli glükoos,teises maltoos . Mõlemassse katseklaasi tekkis kontsentreeritud väävelhappe lisamisel purpurne vahekiht.See näitab,et tegemist on süsivesinikuga,valkudega selline reaktsioon ei toimu.
2.Osasoonide saamine
Osasoonid-süsivesinikute derivaadid,mis tekivad redutseeriva suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga.Osasoonid kristalluvad lahustest hõlpsasti välja,kusjuures tekkivate kristallide kuju järgi on võimalik eristada ka neid suhkruid,mille stereostruktuurid erinevad vaid ühe kiraalse tsentri konfiguratsiooni poolest.
H OH HC N NH
C C N NH
CHOH CHOH
CHOH O + 2 NH
CHOH
CHOH CHOH
CH CH2OH
CH2OH
Töö käik:
Kahte katseklaasi valan 2 ml erineva taandava suhkru lahust. Mõlemasse lisan 0,1 g fenüülhüdrasiini ja 0,2 naatriumatsetaati ja loksutan, et need lahustuksid. Soojendan reaktsioonisegu 40 minutit keeval veevannil aeg-ajalt loksutades ja seejärel jahutan jäävannil.
Tulemus:
Esimeses katseklaasis oli glükoosi lahus, teises – maltoosi lahus. Mõlemate lahuste värv oli kollane.Reaktiivid olid lisatud piisavases hulgas ja lahuses tekkisid kristallid pärast jahutamist. Mida saate osasoonide tekkimisest suhkrute kasutatud kohta üldistavalt järeldada?
Glükoos:Nagu kollased heinatuustad. Maltoos:Nagu kollased lilled.
Järeldus:
Osasoonide tekkimine tõestas,et tegimist oli redutseeriva suhkruga.Siit võin järeldada,et glükoos ja maltoos on taandavad suhkrud.
3.Hõbepeeglireaktsioon
Tandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm taandab mitmete metallide sooli. Hõbeda ammoniakaalsest lahusest sadestub metall klaasi pinnale peeglina.
O O
R C + 2 [Ag(NH3)] + + H2O 2 Ag + R C + 2 NH4+
H H
Töö käik:
Katseklaasi valan 1 ml 1% AgNO3 lahust, lisan 0,5 ml kontsentreeritud NH4OH ja 1 ml glükoosi lahust. Ettevaatlikult soojendan segu.
Tulemus:
Hõbe saadestus seintele õhukese peeglina.See tähendab,et lahus sisaldas glükoosi. Glükoosi lisasite te ise katseklaasi. Mida saab antud katsest järeldada glükoosi kohta? Glükoos on taandav suhkur,sest katseklaasi pinnal tekkis peegel . Aldehüüdrühm oksüdeerus metalliga.
4.Sahharoosi hüdrolüüsi kontrollFehlingi lahustega
Fehlingi reaktiiv on üheks levinumaks reaktiiviks taandavate suhkrute määramisel. Fehlingi reaktiiv on vask(ΙΙ)-tartraatkompleks, mis saadakse Fehlingi Ι ja Fehlingi ΙΙ lahuste kokkusegamisel.
2 NaOH + CuSO4 = Na2SO4 + Cu(OH)2
HO CH COONa O CH COONa
Cu(OH)2 + Cu + 2 H2O
HO CH COOK O CH COOK
K, Na- tartraat Fehlingi reaktiiv
Tekkiv vask(ΙΙ)-tartraatkompleks reageerib aldooside või ketoosidega kohaselt. Vaba poolatsetaalse hüdroksüülrühma toimel vask taandub, andes vask(Ι)oksiidi, mis moodustab punase sademe. Suhkur aga oksüdeerib vastavaks happeks .
O CH COONa H
2Cu + R C + 2 OH- Cu2O +
O CH COOK O punane
OH HO CH COONa
+ R C + 2
O HO CH COOK
Reaktsiooni annavad ainult taandavad suhkrud.
Töö käik:
Kahte katseklaasi valan 1 ml sahharoosi lahust, ühte katseklaasi lisan 1 tilk kontsentreeritud HCl. Mõlemat lahust kuumutan 10 minutit 80-85kraadises veevannis ja mõlemale lisan 1 ml Fehlingi Ι ja ΙΙ lahust.
Tulemus:
Esimeses katseklaasis ,kus on sahharoos ja konts.HCl,põrast kuumutamist ja Fehlingi reaktiivi lisamist lahus muutus punaseks (Cu2O). HCl lisamisel toimub sahharoosi hüdrolüüs, edasi reageerivad juba glükoos ja fruktoos .
Teises katseklaasis ,kus oli ainult sahharoos, lahus ei reeageeri Fehlingi reaktiividega,sest see on mitte taandav suhkur.
5.Barfoed’ reaktsioon
Barfoed’ reaktiiv on vaskatsetaadi (Cu(CH3COO) 2) lahus äädikhappes. Seda kasutatakse taandavaid mono- ja disahhariide eristamiseks. Nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske ainult monosahhariidid. Millises happelises keskkonnas? Eelmises katses oli ka happeline keskkond.
Töö käik:
Võetan kaks katseklaasi ning pipeteerin ühte 1 ml monosahhariidi lahust ja teise taandavat disahhariidi. Lisan 3 ml Borfoed’ reaktiivi, segan hoolikalt ning kuumutan keeval vesivannil kuni 3-4 minutit.
Tulemus:
Pärast ainete segamist mõlemad lahused olid sinist värvi.Pärast kuumutamist,katseklaasis,kus fruktoos tekkis Cu2O sade.Sade tekkis,sest tegemist on monosahhariidiga.Teises katseklaasis maltoosiga sade ei ole tekkinud,sest maltoos on disahhariid,aga disahhariidiga reaktsioon ei toimu.
6.Selivanoff’i reaktsioon
Suhkrute kuumutamisel moodustub pentoosidest heterotsükline aldehüüd furfurool, heksoosidest hüdroksümetüülfurfurool. Need ühendid reageerivad mitmealuseliste fenoolidega, andes värvilisi produkte.
O
Pentoosid C furfurool
O H
O
Heksoosid HOCH2 C hüdroksümetüülfurfurool
H
Selivanoffi reaktiiv sisaldab soolhapet, kondenseeriva agendina resortsinooli ja FeCl3 katalüsaatorina.
Töö käik:
Ühte katseklaasi valan 1 ml fruktoosi lahust, teise sama hulk glükoosi lahust. Lisan 2-3 ml Selivanoffi reaktiivi ja soojendan 4-5 minutit keeval veevannil.
Tulemus:
Katseklaasis fruktoosiga kolme minuti pärast lahuse värvus muutus roosaks.teises katseklaasis glükoosiga varvus ei muutunud. Mida saate siit fruktoosi ja glükoosi kohta järeldada?
Järeldus:
Reaktsioon fruktoosiga toimub kiiremini ja intensiivsemini, kui glükoosiga.Fruktoosi puhul on tegemist ketoosiga ja glükoosi puhul aldoosiga,sest ketoosiga reaktsioon toimub kiiremini ja intensiivsemi,kui aldoosiga.
7.Tärklise reaktsioon joodiga
Tärklisel on iseloomulik omadus moodustada joodiga lillakassiniseid komplekse. Selle põhjuseks on polüsahhariidahelate keerdumine joodi molekulide ümber. Kõrgemal temperatuuril kompleksid lagunevad ja kaotavad värvuse.
Töö käik:
Katseklaasi valan 5 ml tärkliselahust ja lisan1 tilk joodilahust. Kuumutan reaktsioonisegu keemiseni. Seejärel jahutan katseklaasi alumine pool veevannil.
Tulemus:
Pärast ainete segamist lahuse värvus muutus tumesiniseks,tekkis tärklise kompleks joodiga. See reaktsioon joodiga on pöörduv ja kõrgemal temperatuuril kompleks laguneb ning seetõttu kaos pärast lahuse kuumutamist sinine värvus (värvitu lahus). Jahutamisel kompleksid jällegi moodustuvad ja lahus omandab tumesinist värvi.
Kartuli tärklise terakesed Maisi tärklise terakesed
Kartuli tärklise terakesed on helesinised,nad on umbes 4-5mm läbimõõduga.
Maisi tärklise terakesed on tumedamad,kui kartuli tärklise terakesed ja nad on väiksemad.