Rakendusbioloogia (1)

RAKENDUSBIOLOOGIA
Fundamentaalteadused ja
rakendusteadused
Fundamentaalteadused püüavad välja
selgitada loodusseadusi.
Rakendusteadused otsivad avastatud
loodusseadustele kasutamisvõimalusi.
Tooge näiteid, kus sellest kasu saab?
Bioloogias on samuti...
fundamentaalteadused ...
ja rakendusteadused...
BIOTEHNOLOOGIA ­ rakendusbioloogia
valdkond, kus kasutatakse organisme, et toota
inimesele vajalikke aineid.
Peamiselt bakterid, seened, GM- loomad ja ­
taimed.
Biotehnoloogia eelised:
Säästab energiat
Vähem ja kahjutud jäätmed
Odav tooraine
ja puudused:
Ajakulu vastavate organismide leidmiseks,
kasvatamiseks.
Tundlikkus keskkonnategurite suhtes.
Noored "biotehnoloogid" Tallinna Tehnikaülikooli
Loodusteadustemaja õppelaboris
Mida toodetakse biotehnoloogiliselt?
Toiduainetetööstuses
juba sajandeid:
juust, kohupiim, jogurt
jt. piimatooted.
köögiviljade hapendamine (kurk,
kapsas, seened).
pärmitaigen ­ leib, sai, jne.
Õlle ja veini tootmisel
Toidu omaduste parandamiseks
Seentest saadud ensüümid
(proteaasid) kalgendavad piima
juustu tootmisel,
parandavad leiva ja õlle omadusi.
Pintselhalliku abil toodetakse
hallitusjuustu ja salaamit.
Bakterite ja hallitusseente amülaasi kasut.
siirupi tootmisel (tärklisest sahharoosi).
Funktsionaalne toit
... toidule on lisatud midagi, et see
parandaks inimese tervist.
Biokeefir, biojogurt ­ lisatud
probiootilisi baktereid, mis
parandavad seedimist,
immuunsüsteemi.
"Hellus" sisaldab Eestis
patenteeritud Lactobacillus
fermentum ME-3, mis hävitab
düsenteeria, salmonelloosi ja
ateroskleroosi...
Ka meditsiin kasutab biotehnoloogiat juba
terve sajandi
· Antibiootikumid seentest ja bakteritest
(penitsilliin ja etratsükliin)
A. Fleming avastas penitsilliini 1929.a
· Alkaloidid, mida kasutatakse
Parkinsoni tõve ja migreeni raviks.
Põllumajanduses
· Silo valmistamisel
· Mügarbakterid küntakse mulda.
· Biotõrje (taimekaitsevahendid) ­
- seentest saadud ensüümid peletavad
putukaid ja seenhaigusi.
- feromoonidega meelitatakse kahjurid lõksu
- bakteritoksiin (Bt-toksiin on parim) tapab
putukaid selektiivselt ja inimesele mõju ei
avalda.
Silotorn
· http://www.oldergrupp.ee/index.php/page,ValgeristikRETOR
Biogaas?
Tööstuses
Bioplast ­ laguneb looduses kiiremini.
Biogaas ­ prügimägede lagundamine
bakterite abil
Bakterid lagundavad prügimäed alkoholiks.
B. toodavad ämblikuniiti ­ ülitugev materjal
Bakterid toodavad puuvilla.
Bakterid puhastavad maaki.
Bakterid puhastavad reovett (aktiivmuda).
Pesuvahendites
Ensüümid saadakse bakteritest ja seentest.
Intelligentsed pesupulbrid lagundavad
lipiide, valke, polüsahhariide jne.
RAKU- JA EMBRÜOTEHNOLOOGIA
Kloonimine on geneetiliselt identsete järglaste
saamine,
Ka vegetatiivne paljunemine on kloonimine.
Meristeempaljundus on uuem meetod:
Meristeemrakud on diferentseerumata ja
paljunemisvõimelised.
Nad on totipotentsed ­ "kõikvõimelised".
Kasvukuhikust võetakse mõned rakud, pannakse
söötmesse (steriilselt).
Ühest meristeemist võib saada sadu võrseid.
Saadakse viirusvabasid taimi:
kartul, maasikas, nelk, krüsanteem.
http://oregonstate.edu/potatoes/CSS322WebNotes.html
Hübridoomitehnoloogia ja
monoklonaalsed antikehad
· Teatud antigeen viiakse hiiresse.
· Hiires tekivad vastavaid antikehi tootvad B-
lümfotsüüdid.
· B-lümfotsüüdid viiakse kokku kasvajarak-
kudega ­ need on hübridoomid.
· Selektiivsöötmel jäävad ellu ja paljunevad ainult
hübridoomid.
· Nüüd on puhaskultuur ühte tüüpi antikehi
tootvatest, hästi paljunevatest rakkudest.
Monoklonaalsete antikehade
Antigeen tootmine
Rakud ühen-
datakse
Kasvajarakud
Antikehasid tootvad paljunevad hästi
B-lümfotsüüdid
http://www3.niaid.nih.gov/
topics/immuneSystem/frontier
Monoklonaalsed antikehad Images.htm
Monoklonaalseid antikehi kasutatakse:
1. Antigeenide määramiseks
2. Teatud valkude puhtaks eraldamiseks
3. Haiguste avastamiseks
4. Rasedustestis. Testjoon värvub ainult siis,
kui proov sisaldab kooriongonadotropiini.
http://thejenniferblog.files.wordpress.com/2008/01/pregnancy_test.jpg
Embrüosiirdamine ja viljastamine in vitro
Superovulatsioonil küpseb lehmal palju munarakke.
Pärast seemendamist pestakse embrüod välja.
Nende hulgast valitakse parimad ja viiakse
surrogaatemasse.
Katseklaasi (in vitro) viljastamise meetod 1970a
Miks tehakse?
Heade omadustega loomalt saab palju järglasi.
Embrüod säilivad sügavkülmutatult, saab
transportida.
Embrüosiirdamine inimesel
Esimene laps sündis Inglismaal 1978.a., Eestis 1993.a.
Nüüd on neid üle 2 miljoni.
Lastetuid abielupaare on Eestis 10 ­ 20%.
Asendusema ei ole Eestis lubatud.
In vitro viibib embrüo ainult 2-5 päeva.
Munarakud võetakse otse munasarjast nõelpipetiga.
Imetajate kloonimine
Embrüonaalkloonimine:
Varase embrüo rakud on totipotentsed,
need eraldatakse ja viiakse mitmetesse
emasloomadesse.
Igast rakust saab areneda tervikorganism.
Kõik nad on geneetiliselt omavahel samad.
Tuumkloonimine
Tuumkloonimine
s.t. keharaku tuuma viimisel munarakku on
saadud uus organism.
1997.a. saadi esimene tuumkloonitud
lammas Dolly.
Katse näitas, et imetajate tuumas on kogu
organismi arenguks vajalik aktiivne
geneetiline info olemas.
Kas Dollyl on ainult tuumadoonori geenid?
Udararakust võeti tuum
Rakud liideti elektri-
impulsiga
Munaraku tuum
eemaldati
Rakk jagunes
nagu embrüo
Embrüo siirdati
Sündis kloon ­
kolmandale lambale
Dolly
http://www.millerandlevine.com/cloning/dolly-fig-13-13.jpg
Kloonitud on hiiri, küülikuid, kasse, lambaid, kitsi,
sigu, muulasid, veiseid, hobuseid jne.
Pole suudetud kloonida ahve, konni.
Tegelikult enamus katsetustest ei õnnestu: nt.
hobune saadi 328 katsetuse tulemusel.
Kloonide eluiga on normaalsest lühem. Miks?
Tegelikult ei ole kloonid väljanägemiselt ja
omadustelt identsed.
Ka ühemunakaksikute sõrmejäljed on erinevad.
Miks kloonida?:
1. Transgeensete organismide saamiseks
2. Mudelhiired luuakse, et leida ravimeid inimese
haigustele.
3. Hävimisohus olevate liikide säilitamiseks:
võetakse hävimisohus looma tüvirakust tuum ja
viiakse see lähedase liigi munarakku. Munarakk
siirdatakse tagasi looma emakasse. Sünnib
hävimisohus liigi esindaja.
Inimese kloonimine?
Miks ebaeetiline?
Põhjenda, kas Georg Otsa, Lennart Meri, Arvo
Pärdi kloonid oleksid samade omadustega?
Reproduktiivsel kloonimisel saadakse
tervikorganism.
Terapeutilisel kloonimisel tehakse embrüo in
vitro ja kasutatakse selle rakke raviotstarbel.
Selline kloonimine legaliseeriti Suurbritannias
2001.a.
Tüvirakud ja rakuteraapia
Selgroogsete tüvirakud on diferentseerumata või
vähediferentseerunud rakud.
Rakuteraapia ­ tüvirakke kasutatakse kahjustunud
kudede taastamisel.
Parimad on sügoodi esimestel jagunemistel tekkinud
rakud ­ totipotentsed.
Embrüoplasti rakud võivad ainete toimel areneda igaks
koeks.
Nabaväädi tüvirakud saavad ka erinevateks kudedeks.
(säilitatakse sügavkülmas)
Täiskasvanu tüvirakud:
Ammu on tuntud vereloometüvirakud.
Viimased uurimused näitavad, et kõikides
kudedes on omad tüvirakud, ka närvikoes.
Mida aktiivsem inimene, seda enam neuronid
paljunevad!
Pealegi saab juba ükskõik millise keharaku
suunata teatud ainetega arenema ükskõik
mis suunas.
Sea rakkudega saab ka inimesi ravida!
Töötatakse inimese südameklappide,
rindade, kõrvade, luude, kõhrede jt.
kehaosade kunstliku kasvatamise kallal.
Katseklaasi-põis hakkas inimeses tööle.
GEENITEHNOLOOGIA
...on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi
saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) ühest
organismist teise või muudetakse muul viisil
geene saadakse GMO.
Organisme, kellele on viidud võõraid geene,
nim. transgeenseteks.
Esimene transgeenne bakter tehti 1973.a.
Nokautorganism ­ organism, kellel teatud geen
on maha surutud.
Geenide ülekandmine on võimalik
restriktaaside abil.
Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid
enesekaitseks ­ need lõikavad DNA lõikudeks, aga
nii, et tekivad üheahelalised otsad ­ "kleepuvad
otsad".
Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse
tõttu võimalik mugavalt liita.
Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse
DNA.
Restriktaas Vektor
Lõigatud DNA Restrikataas
(sama)
Lõigatud
vektor
Kleepuvad otsad ühinevad
Rekombinantne
plasmiid
Kuidas geenid kohale viia?
1. Bakteri plasmiidiga
2. Viirustega
Kui neile on soovitud geen lisatud, nime-
tame teda geenivektoriks.
3. Kullapüstoliga
4. Taimedesse Agrobakteriga
Viirusvektor viib soovitud geeni rakku
Kuidas kergesti aru saada, et soovitud
geen on üle kandunud?
Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud.
Näiteks kasutatakse GFP (helenduv) geeni
markerina:
Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-koodoneid, on
sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees
ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis.
Nii saab üle viidud geeni avaldumist organismis
kindlaks teha: vaatad ja näed, et helendub!
Fluorestseeruv valk ­ GFP on saadud
meduusist.
O.Shimura eraldas esimesena
Nobeli preemia 2008
Plasmiid, mis sisaldab GFP-geeni ja
antibiootikumiresistentsust määravat geeni
Inimese kasvajat
põhjustavale geenile on
lisatud GFP- geen.
See on viidud hiire
rakkudesse ning
nüüd on võimalik
jälgida kasvaja arengut,
siirdeid jne.
Miks bakterirakus ei hakka inimese
geen kohe tööle?
Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on
intronid ja eksonid.
Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult
kokkuliidetud eksonid moodustavad mRNA , mille
alusel sünteesitakse valk.
Kui tahame bakterisse geeni viia, siis peame selle
mRNA alusel tegema DNA - õnneks on avastatud
pöördtranskriptaas, mis selle töö ära teeb.
Nüüd teeb bakter sama valku, mis see geen inimese
rakuski teeb.
RNA trans-
kript
http://faculty.ircc.edu/faculty/tfischer/images/introns-exons.jpg
Bakterid toodavad inimese valke alates
1978.aastast
Esimene oli insuliin.
Inimese kasvuhormoon
Erütropoietiin aneemia raviks
Interferoon, mis reguleerib immuunsüsteemi
Vere hüübimisfaktorid
Difteeria ja teetanuse vaktsiin
Pärmseened teevad B-hepatiidi vaktsiini
Putukarakud toodavad papilloomi vaktsiini
Transgeensed loomad
Esimene transgeenne hiir saadi 1981.a.: roti
kasvuhormooniga kasvas 2 X suuremaks.
Miks hiiri kasutatakse kõige rohkem?
Transgeensete suurimetajate saamine on
keerukas: munarakk kahjustub,
embrüosiirdamine ei ole sageli edukas jne.
Tartus plaanitakse luua lehm, kes toodab
insuliini (Sulev Kõks ja Ülle Jaakmaa).
Näited ravimeid tootvatest loomadest
· GM-kitse piimas antikehad kasvajate vastu
· GM-lehma piimas laktoalbumiin enneaegsetele lastele
· GM-sead toodavad inimese hemoglobiin
Geenitehnoloogia loomade
tõuaretuses
· Sigade ja lammaste kaal kasvas 30%
· Kalkunite munevus suurenes
· Lihaloomad, kelle tailiha ja rasva osakaal
on täpselt määratud
· Forell jt kalad kasvasid 2 korda suuremaks
Transgeensed taimed
Et saavutada:
- putukaresistentsus - Bt-toksiini määrav geen on
viidud taimesse ja mürke polegi vaja (tomat, mais,
puuvill, kartul),
- viirusresistentsus, (papaia)
- herbitsiidiresistentsus (peet, mais, puuvill, lina, raps,
soja, riis)
- suurem saagikus,
- lamandumis- ja külmakindlus,
- viljade pikem säilivusaeg
- paremad maitseomadused,
- suurem toiteväärtus: A-vitamiiniga kuldne riis
Tomat, banaan, mango, .
papaia: pikema
säilivusajaga
Hawail harilike papaia
sortide kasvatamine
keelati, sest need
levitasid viiruseid.
Kõik on GM-papaiad.
GM-taimede kasvatamise levik USA-s
2005.a. seisuga:
· Soja 89%
· Mais 61% (maisi saagikus on tõusnud 30%)
· Puuvill 83%
· Riis
· Raps
· Suurimad kasvatajad: USA, Argentiina,
Kanada, Hiina.
Sordiaretuse ajaloost?
· 10 000.a. tagasi põllumajanduse algus ­ valiti juhuslikult.
· 19. saj. selektiivne ristamine
· 20. saj. algus mutagenees ja selektsioon
· 1987.a. esimesed GM-taimed
· 1990-ndad GM-taimede levik USA-s, Aasias jm.
· 1998.a. EL keelustas kõik GMO-d.
· Nüüd on Euroopas lubatud, kui taotled loa.
(ülikeeruline, meeletu paberi, aja ja raha raiskamine)
GMO-aretuse poolt:
· Kiiremad tulemused
· Geenid teistelt liikidelt
· Geenide avaldumist saab reguleerida
· Teatakse täpselt, millist geeni üle kantakse, mis
muutub uues sordis.
· Põldudel kasutatakse vähem keskkonnamürke.
See on täppissordiaretus.
GMO-aretuse vastu:
· Kahjurid võivad muutuda immuunseks.
· Geenid võivad üle kanduda umbrohule.
· Erinevate organismide geenide koostoime
võib olla ettearvamatu.
· GM-taimede maitseomadused on
tavaliselt halvemad.
Geeninokaut
Geen lülitatakse välja.
On loodud sadade geenide suhtes "nokauti
löödud" hiiri.
Tehnika on keeruline:
1. Geenivektor (vigane geen+marker) viiakse
hiire embrüonaalsetesse tüvirakkudesse.
2. Vektor satub ristsiirdega genoomi.
3. Selektiivsöötmel jäävad ellu mutantsed
rakud, need on nokautrakud.
4. Nokautrakud siiratakse uude
embrüoblasti
5. Tekib kimäärne embrüo
6. See embrüo viiakse hiire emakasse
7. Sünnivad kimäärsed hiired (neid hoitakse)
8. Järgneva ristamise tulemusena sünnib ka
homosügootseid nokauthiiri.
· Mudelhiired ­
haiguste uurimiseks. .
· Organite
kasvatamiseks
GM-loomade baasil.
Geeniteraapia
Inimesel on teada üle 3000 päriliku puude.
Kaks võimalust:
1. Asendada haige geen tervega
2. Vaigistada haige geen.
Neid tegevusi ei tehta munarakuga, need ei
pärandu järglastele.
On kohati häid tulemusi, kuid enamasti
mitte.
Immuunpuudulikkuse ravi oli 1990.a.
suhteliselt edukas
Parkinsonitõve ravi ajutiselt.
Geenivaigistamiseks kasutatakse mikro-
RNA molekule. Kui mi-RNA-d ühinevad
mRNAga, siis viimane lagundadakse.
Nii saaks ravida Huntingtoni haigust.
Geenivaigistamine on täiesti uus suund!
Muid geenitehnoloogia rakendusi
1. Molekulaargeneetiline diagnostika
Enamasti põhineb mutantsete geenide äratundmisel.
DNA-kiibid - võrdlus DNA-lõigud, millega patsiendi geene
kõrvutada ­ saab tuvastada haiguse ja siis vastavalt
määrata ravi (kiibil on markerid)
Paljude haiguste puhul on see juba võimalik: rinnavähk,
tsüstiline fibroos, sirprakuline aneemia, kurtus,
Huntingtoni tõbi jne.
Helenduvad geenid on lisatud vaid markerina, et
olla kindel geeni ülekandes.
Albiino jänes hüppab ringi nagu iga tavaline jänku,
kuid pimedas toas UV-valgusel hakkab helenduma.
Helenduv kärss
Embrüodiagnostika
2. DNA-sõrmejälgede metoodika
Võrreldakse 10 või enama lookuse pikkust:
Lookusi saab DNA-st välja lõigata ja paljundada
väga kiiresti polümerasse ahelreaktsiooni
(PCR) meetodit kasutades.
Lõigatud fragmendid on erineva pikkusega, kuid
lahuses segamini.
See proov pannakse geeli, geel pannakse
elektrolüüsi vanni.
DNA-lõigud jooksevad + pooluse poole, seda
kiiremini, mida lühemad nad on.
PCR metoodika:
Ependorfis segatakse kokku:
nukleotiidid (kõiki nelja erinevat)
DNA-polümeraas
oma DNA lahus
praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on
komplementaarsed analüüsitava DNA-piirkonna
mõlema "otsaga".
Ependorf pannakse 3 tunniks PCR-masinasse.
PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude
paljundamine tänu pidevale temperatuuride
vaheldumisele:
92oC - DNA denatureerub
58°C - praimerid liituvad
72oC - DNA-polümeraas
käivitab replikatsiooni.
See tsükkel kordub
masinas 34 korda.
Fragment, mida
tahetakse paljundada
PCR
Kuumutamisel 90-ni
DNA denatureerub
Praimerid ühinevad
madalamal temp-l
DNA-polümeraas saab replikatsiooni
alustada ainult 3` otsast
Kuumutatakse 90 ­ni, DNA denatureerub
Praimerid ühinevad
DNA-polümeraas replikeerib,
alustades 3`otsast
Need 2 fragmenti
on esimesed
tulemused.
Tsüklit korratakse
34X, saadakse
30 miljonit
Tulemus: uuritavaid DNA-lõike on paljundatud
vähemalt 30 miljonile.
Nii suurt kogust saab näha geelelektroforeesil.
PCR-masinast võetud DNA-proovid pannakse geeli
auku.
· Geel asetatakse
elektroforeesivanni,
· DNA-lõigud liiguvad
+ pooluse poole
seda kiiremini, mida
väiksemad nad on.
Umbes tunni aja pärast näeme UV-
kiirgusel lahutatud DNA-lõikude "bände "
Saame üksteise sarnasusi või
erinevusi näha ja võrrelda.
Tänan tähelepanu eest!