Viroloogia praktikum (0)

Viroloogia
1. Miks pidi lisama LB puljongit , kui olime külviaasaga soft agari tuubi kogunud?
Muidu on soft agar liiga viskoosne , LB-ga teeme vedelamaks.
2. Miks seejärel kasutasime kloroformi ?
Kloroform surmab bakterid , kes faagi käest pääsesid (keda faag ei nakatanud).
3. Miks bakteriofaag lambdat ei saa transduktsioonil kasutada, kuid T4 saab?
Faag lambda integreerub bakteri rõngaskromosoomi profaagina ja väljub sealt nukleotiiditäpsusega (integraasi ja ektsionaasi abil). Madala tõenäosusega võib väljatulek olla ebatäpne ja osa geene on asendunud bakteri omadega, selline faag on defektne ja vajab paljunemiseks helperfaag abi. Faag lambdal algab pakkimine kontaktemeeridest. Faag lambdal pakitakse DNA, mis jääb kahe cos saidi vahele ( spetsiifilised lõikesaidid). T4 toimub pakkimine „headfull „mehhanismi abil ja algab suvalisest DNA segmendist. Esinevad pac saidid.
4. Milleks oli vaja filtreerida?
Saada lahti bakteritest. Kasutasime 0.2 mikromeetrilise poordiameeriga membraanfiltrit. Ainult faagid pääsevad läbi – neid oligi vaja just eraldada.
5. Kui suur on bakterirakk? Joonpikkus 1-10 mikromeetrit.
6. Milleks oli vaja kuumašokk kompetentsete rakkude transformeerimisel?
Tsütoplasma membraan on laetud positiivselt, DNA on laetud negatiivselt Membraanid depolariseeruvad ja DNA transporditakse rakku.
7. Miks ei või 50% EtOH-ga pesta? Sest DNA hakkab siis lahustuma. 70% ei hakka veel lahustuma.
8. Miks on vaja Mg-d restriktaasi puhvris? Kahevalentne katioon, tavaliselt Mg++ on ensüümi tööks absoluutselt vajalik
9. Miks lahus 1? 2? 3?
Lahus 1 sisaldab glükoosi, EDTA ja Tris-HCl. EDTA seob kahevalentseid metallioone, mis on vajalikud nt DNaasi tööks + EDTA aitab stabiliseerida DNA fosfaat selgrooga . Suspendeeritakse puhvris, sest vees võib DNA laguneda.
Lahus 2 sisaldab SDS ja NaOH . Aluseline töötlus, mille käigus detergent SDS lõhub rakumembraani ja alus saab seonduda plasmiidse DNAga, mis seejärel denatureerub. Aluselises keskkonnas rakud lüüsuvad ja DNA denatureerub. Segada õrnalt.
Lahus 3 sisaldab KOAc (kaaliumoksaalatsetaat). See neutraliseerib lahust ja lubab plasmiidse DNA renatureerimise ja KOAc aitab sadestada detergendi (SDS). Kuna viiruse genoom on väiksem, siis renatureerub ta kiiremini kui bakteri 4Mb suurune kromosoom . Kromosoom ei jõua kaheahelaliseks minna.
10. Miks RNA töötlus?
RNaasi töötlus aitab veelgi puhtamaks saada puhastatavat DNA lahust. RNaas lagundab RNA rakkudes.
11. Millist tüüpi restriktaase kasutame?
tüüp 2 - lõike- ja seondumissait kattuvad. Lõikavad vaid dsDNA-d (ainult ds lineariseerub, ss jääb tsirkulaarseks - tsirkulaarne jookseb geelil kiiremini - saab neid eristada). Tunneb ära 6-nukleotiidilise järjestuse GAATTC. Vajab tööks Mg++. Lõigatud otsad jäävad üheahelaliseks (aka. kleepuvad otsad).
12. Miks ei või geeli vette teha vaid peab puhvrisse panema ?
Agaroosgeel peab olema tehtud puhvrisse, sest kui seda jooksutada ka puhvris ja kui geel on tehtud vette, siis Tris puhver tõmbab geelist vee välja. Tagab stabiilse pH. Oluline, sest DNA/RNA laeng sõltub keskkonna pH-st.
13, Miks kasutatakse laadimispuhvrit ja mis on see tavaliselt?
DNA proovide kandmisks geelile kasutatakse laadimispuhvrit, mis sisaldab glütserooli. Proov vajub kaevukese põhja.
13. Miks sisaldab puhver ka etiidiumbromiidi?
Selleks, et hiljem visualiseerida DNA froees UV-valguses (254 nm).
14. Mis suunas liiguvad geelis molekulid?
Liiguvad agaroosgeelis elektrivälja rakendamisel katoodilt anoodile (+).
15. Kui sul on kaks E.colit, mida teed, et teada saada kas RecA on olemas?
1) PCR
2) UV-ga kiiritad
UV-ga kiiritad. Kui RecA on olemas, siis aktiveerib see RecA proteolüütilist stimuleeriva fn-i. RecA aktiveerib LexA autokatalüütilise proteolüüsi ja LexA vabastab enda kontrolli alt olevad SOS reparatsioonigeenid. LexA on repressor ja tavaolukorras on tema kontrolli all olevate geenid ekspressioon takistatud (Uvr). RecA käivitab reparatsioonimehhanismid.
16. Mis tekitab UV?
Tekitab DNA ahelas tümiini dimeere, häirivad edasist replikatsiooni (takistavad DNA polümeraasil edasi liikumast)
17. Mis siis saab, kui RecA-? On palju tundlikum UV-le. Ainus kaitse, mis olemas, on fotolüaas. See on valgusest sõltuv ensüüm .
18. Mis on Com valgud ?
Kompetentsuse saavutamiseks on vajalikud feromoonid (CSF ja ComX). Nende kontsentratsiooni tõustes, sünteesitakse edasised kompetentsusvalgud. Haemophilus influenzae ei erita feromoone, vaid muutub kompetentseks, kui satub statsionaarsesse faasi (C-nälg). Transforosoom – raku pinnal olev DNA retseptorsait.
19. Millega fenooli saaks ekstraheerida? Kloroformiga.
20. Mida teeb puhtal kujul fenool DNA-ga ja kust tuleb fenooli kollane värvus? Fenooli on vaja eelnevalt küllastada veega. Fenool seob 10% vett ning puhta fenooli lisamine DNA-le eemaldab vee ka DNA-st. Lisaks puhas fenool toatemperatuuril kipub tahkuma. Oma kollase värvuse on saanud ta antioksüdantidest.
21. Miks DNA eraldamisel kasutati fenool/kloroformi? Fenool sadestab valgud ja lipiidid. Kloroform aitab paremini säilitada piirpinda fenooli ja veefaasi vahel.
22. Miks DNA eraldamisel on vajalik sadestamine ? Sadestamine aitab proovi kontsentreerida, 70% EtOh aitab veel soolasid välja pesta (ensüümid ei tööta, kuid DNA lahuses on soolad).
23. Miks kasutati 70% etanooli dsDNA eraldamisel ja 96% etanooli ssDNA eraldamisel? 70% EtOH on piiriks, mil DNA veel ei hakka lahustuma. 96% EtOH + NaAc kasutatakse ssDNA puhul, kus Ac aitab hoida keskkonda happelisemana. DNA on vees lahustuv, kuid 70% EtOH-s mitte. Kangem EtOH ei pese välja soolasid lahusest, kuid 70% teeb seda.
24. Millest sõltub faagi valik üldise transduktsiooni puhul? Faag peab pakkima DNA-d, mis a) pole väga suure tundlikkusega cat saidi suhtes; b) sobiva genoomi suurusega; c) retseptor -antiretseptor seondumine.
25. Mille poolest erinevad T4 ja M13? T4 on lüütiline faag ehk ta tapab kõik bakterirakud oma elutegevuse käigus (faagilaikudes pole ühtegi bakterit). M13 on aga lüsogeenne faag, mis ei lüüsi oma rakke, vaid aeglustab nende kasvu (faagilaikudes võivad olla mõned rakud).
26. Kirjelda M13 elutsüklit. Faag M13 kinnitub raku F-piilile. Nakatumise ajal vabaneb kattevalgust DNA, mis siseneb rakku. Rakku sisenenud üheahelalisele DNA-le sünteesitakse komplementaarne ahel ning moodustub kaksikahelaline tsirkulaarne replikatiivne vorm (RF). Seejärel hakatakse RF-lt tegema üheahelalisi DNA molekule „veereva ratta“ mudeli järgi. Samal ajal sünteesitakse ka vajalikud kattevalgud. Edasi toimub partiklite kokkupakkimine raku periplasmas ja väljub.
27. Mõisted:
Transduktsioon – faagide poolt vahendatud geneetilise informatsiooni ülekanne ühest rakust teise. Jaguneb üldine – suvalise geneetilise markeri suhtes (faag ei integreeru kromosoomi, lisaks peab DNA fragment sisaldama pac saiti ja olema ka suuruse poolest sobiv) ja spetsiifiline – ülekantavad geenid pärinevad kindlast kromosoomi alast, mis külgneb sinna insertseerunud profaagiga.
Kompetentsus – bakteri võime transportida väliskeskkonna DNA-d. Transformatsioon – DNA viimine kompetentsetesse rakkudesse, mille tagajärjel omandavad nad uusi tunnuseid. Homoloogiline rekombinatsioon - protsess, kus kaks sarnast või identset DNA molekuli vahetavad nukleotiidseid järjestusi.
28. Milline molekul jookseb froeesil kõige paremini?
Lineaarne DNA jookseb kiiremini kui tsirkulaarne DNA.
29. Transduktsiooni etapid:
1. Faag kinnitub oma antiretseptoriga bakteriraku retseptorile. Nakatamise ajal toimub faagi DNA viimine bakterirakku.
2. Bakteri kromosoom fragmenteeritakse. Viiruse DNA-d hakatakse paljundama ja lisaks kasutab peremehe transkriptsioonisüsteemi ja translatsiooniaparaati oma komponentide sünteesiks
3. Viirus pakib oma genoomi kapsiidi ja sellal võib sagedusega 10-6 pakkida oma geenide asemel hoopis bakter geneetilist materali. Selline faag on defektne, kuna ei suuda enam lüüsida rakke (vajalikud geenid ei pakkinud kaasa).
4. Rakk lüüsub ja uued viiruspartiklid väljuvad.
5. Faag nakatab uut peremeest . Toimub sama mis eelnevalt. Samas, retsipient ja doonor on samast liigist ja omavad omavahel geneetiliselt suurt homoloogiat – uude rakku süstitud DNA rekombineerub uue peremehe kromosoomi.