mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi (valmistatakse kõrge konsentratsiooniga lahuses, võttes üks ühele hulga ja triloon-B). Antud reaktiiv täidab kahte rolli: · Tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile mille pH 4,8 inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni. · Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)- triloon B kompleksi. Taandavaid suhkruid sisaldav reaktsioonisegust võetud proov viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon-B. Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades kindlakonsentratsioonilist 0,02M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon-B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi
See valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja etüleendiamiintetraäädikhappe dinaatriumi soola. See reaktiiv täidab vaadeldava meetodi puhul kaht rolli: tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni; tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov, mis sisaldab taandavaid suhkruid, viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0.02M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub
inaktiveerivalt. Lõpetab ensüümreaktsiooni b) Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise kk-a ja vask(II)-triloon B kompleksi Kompleksi valmistamine: .võetakse ekvimolaarsete hulkades (1:1) CuSO4 ja etüleendiamiintetraäädikhappe dinaatriumsoola (EDTA-Na, tuntud kui triloon B) .kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahus Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov (sisaldab taandavaid suhkruid) viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuri toimel: 1. suhkrute toimel taandub kompleksis sisalduv Cu(II)Cu(I). Moodustub Cu2O. Eraldub reaktsioonisegust punase sademena. 2. Lahusesse jääb ekvivaletsetes kogustes vaba triloon B Reaktsioonil vabanenud triloon B kogus tehakse kindlaks tiitrimise teel: - Kasutada tuleb 0,02 M vasksulfaadi lahust - Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega
Sahharoos hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel vastavalt reaktsioonivõrrandile: Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi a fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks viiakse kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov, mis sisaldab taandavaid suhkruid, komplekslahusesse (triloon B). Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Keetmisel toimub reaktsioon: Reaktsioonil vabanenud triloon B kogust määratakse tiitrimise teel, kasutades selleks 0,02 M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-
(pH ~7,2) ja leelisproteaase (pH ~9,0). Aktiivtsentri ehituse järgi jaotatakse proteaasid põhiliselt seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasideks. Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ehk märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise. Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel
tavaliselt kaseiini. Kaseiin on piima põhivalk, mis on koostiselt fosfoproteiin. Kaseiin esineb piimas mitsellidena, sest omab kõrget hüdrofoobsust. Piimast eraldatud kaseiin enamjaolt vees ei lahustu. Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ehk märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka edasise hüdrolüüsi. Pärast sademe eraldamist jäävad lahusesse vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel
Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV piirkonnas lainepikkustel ja tänu sellele on nad spektofotomeetriliselt hästi detekteeritavad. Joonis . Aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete neeldumisspektrid. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni
kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin (Tyr), trüptofaan (Trp) ja fenüülalaniin (Phe) omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkustel 270280 nm ja tänu sellele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorbtsioon ( opiline tihedus, A) on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A versus CTyr leitakse
Saadud produktide koguse kindlaks määramiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks tugevalt aluseline lahus, kus on vask(II)-triloon B kompleks. Tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile muudab ta invertaasi, mille pH opt=4,8, inaktiivseks ja lõpetab ensüümireaktsiooni. Samas tagab ta ka taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud taandavaid suhkruid sisaldav proov viiakse komplekslahusesse ning keedetakse, mille käigus taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub punase sademena sadenev Cu2O ning lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B: Jägnevalt tuleb määrata tiitrimise teel triloon B kogus, kasutades 0,02M vasksulfaadi lahust ning indikaatorine mureksiidi. Tiitrimisel komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ning seda näitab ka indikaator:
kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadidega Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0). Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg).
Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüs) läbiviimine Pipeteerisin 50 ml mahuga katseklaasi 25 ml 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH-ga 4,8 (substraat). Sulgesin katseklaasi korgiga ning asetasin vesitermostaati 30°C juurde soojenema 10 minutiks. Pipeteerisin kolme 250 ml-sse koonilisse kolbi 10 ml komplekslahust. Kui substraat oli saavutanud termostaadis temperatuuri 30°C, lisasin sinna 1 ml invertaasi töölahust, loksutasin ning võtsin sellest reaktsioonisegust 1 ml lahust ja viisin ühte komplekslahusega kolbi (0-proov). Seejärel asetasin katseklaasi tagasi termostaati. 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin reaktsioonisegust 1 ml lahust ning viisin teise komplekslahusega kolbi. 20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin veel 1 ml reaktsioonisegu ning viisin selle kolmandasse kolbi. Reaktsiooniproduktuide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
Lisan 9,5 ml atsetaatpuhvrit. 2. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine Pipeteerisin 50 ml mahuga katseklaasi 25 ml 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH-ga 4,8 (substraat). Sulgesin katseklaasi parafilmiga ning asteasin vesitermostaati 30°C juurde soojenema. Pipeteerisin kolme 250 ml koonilisse kolbi 10 ml komplekslahust. Kui substraat oli saavutanud termostaadis temperatuuri 30°C, lisasin sinna 0,5 ml invertaasi töölahust, loksutasin ning võtsin sellest reaktsioonisegust 1 ml lahust ja viisin ühte komplekslahusega kolbi (0-proov). Seejärel asetasin katseklaasi tagasi termostaati. 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin reaktsioonisegust 1 ml lahust ning viisin teise komplekslahusega kolbi. 20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin veel 1 ml reaktsioonisegu ning viisin selle kolmandasse kolbi. 3. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
Sahharoosi hüdrolüüsi küigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse nn kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Nimetatud kompleks valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades (1:1) CuSO4 ja etüleemdiamiintetraäädikhappe dinaatriumi soola (EDTA-Na, tuntud kui triloon B). Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov, mis sisaldab taandavaid suhkruid, viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub komplesis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-
Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhines sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Kasutasin kvantitatiivset meetodit tiitrimist. Antud töös leidis kasutamist nn kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiv sisaldas vask(II)-triloon B kompleksi ja oli tugevalt aluselise reaktsiooniga. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud taandavate suhkrutega proovi viisin komplekslahusesse. Seal olev vask(II)-triloon B kompleks laguneb reaktsioonil suhrutega ning lahusesse jääb vaba triloon B. Järgnes vabanenud triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi.
Polarisatsi mõõdetakse polarimeetri abil Töövahendid. Polarimeeter KRÜSS, kolb suhkrulahuse segamiseks Töö käik. 1) Esmalt täidetakse polarimeetri toru (toru pikkus l=100 mm) määratletud kon suhkrulahusega 2) valatakse suhkrulahus polameetri torust välja 3) Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi kolvis 25 ml-le suhkrulahuse lahust, ning koheselt fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg, 4) Loputatakse polarimeetri toru ja täidetakse (mullideta!) reaktsioonisegust võ polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka 5) Esimene mõõtmine võetakse lühimal ajahetkel, mis võimalik. Edasi teostata tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida a 4) Loputatakse polarimeetri toru ja täidetakse (mullideta!) reaktsioonisegust võ polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka 5) Esimene mõõtmine võetakse lühimal ajahetkel, mis võimalik. Edasi teostata
Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270-280 nm ja tänu sellele on spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (A v D) uuritavas lahuses. Katse käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Valmistasin uuritavast proteaasi preparaadist, milleks oli savinaas, ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahuse, milles ensüümi kontsentratsioon oleks vahemikus 1-5 mg/mL. Pidin valmistama 5 mL lahust kontsentratsiooniga 1,5 mg/mL. Selleks kaalusin
hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270-280 nm ja tänu sellele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõtsin kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust ( = absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorbtsioon on tingitus kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonia mg/ml või µmol/ml. Kasutasin olemasolevat kaliibrimissirget A versus CTyr
1.4 Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine Võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati ( 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8). Sulgesin katseklaasi korgiga ja asetasin umbes 5 10 minutiks vesitermostaati 30 ± 1ºC juurde soojenema. Võtsin kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust. (Kolbidesse viiakse reaktsioonisegust(=hüdrolüüsisegust) kindlatel aegadel võetud proovid, neis määratakse taandavate suhkrute sisaldus). Kui substraat oli termostaadis saavutanud temperatuuri 30 ºC ( u 5-10 min pärast ), lisasin sellele 2 ml uuritavat invertaasi töölahust, lahuse pidi läbi loksutama ja kiiresti asetama termostaati tagasi. Samal ajal fikseerisin ensüümireaktsiooni alguse aja kella järgi.
ensüümireaktsioonide kaskaadidega Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0). Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse
kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadidega Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0). Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg).
polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ehk märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise. Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need
hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsionisegu proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust ehk optilist tihedust (D)/absorptsiooni (A). Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või mikromooli/ml (1 mikromool = 181 mikrogrammmi = 0,181 mg), kuigi lahuses võib olla ka teisi aromaatse tuumaga aminohappeid. Antud kaliibrimissirge abil leitakse A väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Töölahuse valmistamine: Valmistada uuritavast proteaasi preparaadist ensüümile sobiva pH-ga puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon on vahemikus 1-5 mg/ml. Arvutada välja ensüümipreparaadi kaalutise suurus. Vajalik kogus ensüümpreparaati viia kadudeta lahuse valmistamiseks sobivasse anumasse, lisada väike kogus puhverlahust ning segada klaaspulgaga umbes 5 minutit, kuni ensüüm on lahustunud. Selget lahust ei teki, kuna preparaadis sisaldub
hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsionisegu proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust ehk optilist tihedust (D)/absorptsiooni (A). Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või mikromooli/ml (1 mikromool = 181 mikrogrammmi = 0,181 mg), kuigi lahuses võib olla ka teisi aromaatse tuumaga aminohappeid. Antud kaliibrimissirge abil leitakse A väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Töölahuse valmistamine: Valmistada uuritavast proteaasi preparaadist ensüümile sobiva pH-ga puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon on vahemikus 1-5 mg/ml. Arvutada välja ensüümipreparaadi kaalutise suurus. Vajalik kogus ensüümpreparaati viia kadudeta lahuse valmistamiseks sobivasse anumasse, lisada väike kogus puhverlahust ning segada klaaspulgaga umbes 5 minutit, kuni ensüüm on lahustunud. Selget lahust ei teki, kuna preparaadis sisaldub
sisaldavate amh-te sisalduse alusel Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped: 1. Tyr (türosiin) 2. Trp (trüptofaan) 3. Phe (fenüülalaniin) Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldust väjendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või mol/ml (1 mol= 181 g=0,181 mg). Kui kasutada kaliibrimissirget A vs CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. 3.2.2 Töö käik ENSÜÜMPREPARAADIST TÖÖLAHUSE VALMISTAMINE: 1. Valmista uuritavast protaasi preparaadist (ALKALAAS) ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus. NB! Ensüümi kontsentratsioon olgu vahemikus 1-5 mg/ml 2. Kooskõlasta juhendajaga: · Alkalaasile sobiv puhver Boraatpuhver, pH= 8,4 · Lahuse täpne maht 5 ml · Alkalaasi kontsentratsioon lahuses 1,66 mg/ml 3
Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 Pro) Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0). Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat
Paneme gradueeritud katseklaasi 15mg enne kaalutatud preparaadi ja lisame puhverlahust 5ml kriipsuni.Segame 5 minuti. Ensüümi reaktsiooni läbiviimine: · Võtme suur 50 ml katseklaas kuhu pipeteerimie 25 ml substraati(7%line saharoosatsetaatpuhvris pH=4.8). Katseklaas asetataske 5-10 minutiks vesitermostaati 30C juurde. · Võtame 3 koonilist 250 ml kolbi, kuhu pipiteerimime 10 ml komplekslahust.Pärast kolbidesse viiakse reaktsioonisegust võetud proovid. · Võtame termostaadist 50 ml katseklaas substraadiga ja lisame 1ml ensüümilahust. Loksutame. Kohe võetme reaktsioonisegust 1ml lahust ja lisame esimesse 250 ml kolbi. (See on null proov). Fikseerime aega ja paneme reakstioonisegu tagasi termostaati. · 10ndal ja 20ndal minutitel võtame ka teine ja kolmas proov ja lisame neid 250 kolbidese. · Selle tulemusena mneil on 3 250 ml-list kolbi kus asuvad erineval ajal proovid ja komplekslahus
atsetaatpuhvris), katseklaas varustada korgiga, asetada 5-10 minutiks vesitermostaati 30C juurde soojenema. · Kolme koonilisse kolbi pipeteerida 10 ml komplekslahust. · Kui substraat on termostaadis saavutanud vajaliku temperatuuri (30C), lisada sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust, loksutada ning asetada tagasi termostaati. Fikseerida ensüümireaktsiooni aeg! · Kohe pärast läbiloksutamist võtta reaktsioonisegust kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viia ühte kolbidest, kus on komplekslahus. See on 0-proov ning proovi võtmine peab toimuma võimalikult kiiresti. · 10 minutit pärast ensüümireaktsiooni algust võtta sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viia 2. kolbi. · 20 minutit pärast ensüümireaktsiooni algust võtta sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viia 3. kolbi. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
Meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsoonisegus. Antud töös kasutatakse glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemisel kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov, milles on taandavad suhkrud, viiakse komplekslahusesse. Keemisel taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)- ks ja Cu2O eraldub punaka sademena. Keetmisel toimuv reaktsioon: Tiitrimisel määratakse vabanenud triloon B kogus, kasutades 0,02M vasksulfaadi lahust, tekib uuesti kompleks, mida näeb lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimisel toimuv reaktsioon: Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi koguse järgi leitakse kalibreerimisgraafikult
Seejärel kordasin toimingut, võttes jälle pipetiga 1 mL reaktsioonisegu ja lisades järgmisesse koonilisse kolbi komplekslahusele. Panin kolmandat korda reaktsioonisegu tagasi vesitermostaati ja lasin veel olla 10 ning toimisin jälle samamoodi. Lõpetuseks eemaldasin reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine Kolvid, mis sisaldasid komplekslahust ja erinevatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proove, panin elektripliidile püstjahutite alla keema 10 minutiks. 10 minutit pärast keemise algust lõpetasin keetmise lisades läbi püstjahuti kolbidesse 150 mL destilleeritud vett. Vedeliku maht kolvis suurenes ja indikaatori värvuse muutus peaks niimoodi olema paremini märgatav tiitrimisel. Võtsin kolbid pliidilt ja jahutasin kraani all maha. Lisasin igasse kolbi 6 tilka mureksiidi vesilahust kui indikaatorit, mis andis lahustele õrnalt violetse tooni.
reaktsioonisegu ja lisades järgmisesse koonilisse kolbi komplekslahusele. Panin kolmandat korda reaktsioonisegu tagasi vesitermostaati ja lasin veel olla 9 minutit (st ensüümireaktsiooni algusest 10+9=19 minutit ehk 1140 sekundit) ning toimisin jälle samamoodi. Lõpetuseks eemaldasin reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine Kolvid, mis sisaldasid komplekslahust ja erinevatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proove, panin elektripliidile püstjahutite alla keema 10 minutiks. 10 minutit pärast keemise algust lõpetasin keetmise lisades läbi püstjahuti kolbidesse 150 mL destilleeritud vett. Vedeliku maht kolvis suurenes ja indikaatori värvuse muutus peaks niimoodi olema paremini märgatav tiitrimisel. Võtsin kolbid pliidilt ja jahutasin kraani all maha. Lisasin igasse kolbi 3 tilka mureksiidi vesilahust kui indikaatorit, mis andis lahustele õrnalt violetse tooni.
tähtaineid. Ensüümreaktsiooni(sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine · Võtsin 50 mL-st katseklaasi ja pipiteerisin 25 mL 7%-list sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8(see on substraat). Panin korgi katseklaasile ja asetasin 10 minutiks vesitermostaati 30oC juurde soojenema. · Võtsin kolm 250mL-st kolbi ja pipeteerisin igaühe sisse 10 mL komplekslahust. Põhimõtteks on viia reaktsioonisegust kindlatel aegadel võetud proovid, et neis määrata taandavate suhrute sisaldust. Pärast 6 min soojendamist. kui substraat saavutas 30oC lisasin sellele 1 mL invertaasi töölahust, loksutasin seda. Kiiresti pärast loksutamist võtsin kuiva pipetiga 1 mL sellist lahust ja viisin seda esimese kolbi sisse, kus on kompleks lahus.Samal ajal käivitasin stopperit, et fikseerida ensüümreaktsiooni algust.
Funktsionaalderivaadid funktsionaalrühmi sisaldavad ühendid. Estrid on orgaanilised ühendid, mis tekivad happe vesinikuaatomite asendumisel süsivesiniku radikaalidega. Amiidid on karboksüülhapete funktsionaalderivaadid, kus -OH rühma asemel on aminorühm (-NH2). Reaktsiooni kiirus on reaktsioonis osaleva aine kontsentratsiooni muutus ajaühikus. Katalüsaator on keemiline aine, mis muudab reaktsiooni kiirust. Katalüüs on keemilise reaktsiooni kiiruse muutus tänu reaktsioonis osalevale spetsiifilisele lisandile. Pöörduv reaktsioon on kahes suunas toimuv keemiline reaktsioon. Keemiline tasakaal on keemilise süsteemi püsiv olek, mis saabub pöörduva keemilise reaktsiooni kulgemise tulemusena. Eksotermiline reaktsioon on keemiline reaktsioon, mille käigus eraldub soojust. Endotermiline reaktsioon on keemiline reaktsioon, mille käigus neeldub soojust. 4. Estreid kasutatakse lille- ja puulõhnade tõttu puuviljaessentsidena muuhulgas karastusjook...
Tekkinud reaktsiooniproduktide, glükoosi ja fruktoosi, koguse kindlaks tegemiseks kasutatakse antud töös kompleksomeetrilist meetodit, kus põhiliseks reaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)triloon B kompleksi. Hüdrolüüsisegust võetud, taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades vask(I)oksiidi, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust. Töö käik: 1. Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks kasutasime suuremat katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml 7% sahharoosi lahust, mis oli substraadiks ja mille pH oli 4,8. Lahuse asetasin vesitermostaati 30 kraadi juurde soojenema. 2
Sahharoos -> glükoos + fruktoos Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määrmaisel reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse määramiseks võetakse põhireaktiiviks tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Kindlatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proovid viiakse komplekslahusesse. Keemisel taandub vask ja moodustub Cu2O, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B, mille kogus määratakse tiitrimisega, kasutades 0,02M vasksulfaadi lahust ja indikaatorit mureksiidi. Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse hulga järgi leitakse taandavate suhkrute kontsentratsioon (kaliibrimissirgelt). Töö käik Kasutati tahket invertaasi, mida kaaluti 0,01g ja millele lisati 5ml atsetaatpuhvrit, mille pH=4,8
kontsentratsiooni määramisel segus. Töös kasutasime kompleksomeetrilist meetodit, milles põhireaktiiviks on -triloon-B kompleks (tugevalt aluseline). Seda valmistatakse , ja triloon-B lahustest (siin kasutan eelnevalt valmistatud segu). Sellel reaktiivil on antud töös 2 rolli: · inaktiveerib invertaasi (kompleksil on kõrge pH), kuna invertaasi , · tagab taandavate suhkrute määramiseks leeliselist kekkonda ja vask()-triloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub taandavate suhkrute toimel -ks, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb ekvimolaarses koguses vaba triloon-B. Järgneb triloon-B kontsentratsiooni määramine tiitrimisel kasutades 0,02 M lahust. Toimub vase taaskomplekseerumine triloon-B-ga ja seda saab visualiseerida, kui lisada lahusesse indikaator mureksiid (lahuse värvus muutub violetsest roheliseks). Tiitrimiseks kulunud mahu järgi
ensüümiraktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetud, taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta. (µkat/ml). TÖÖ KÄIK Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks võeti 50 ml katseklaas, kuhu pipeteeriti 25 ml 7 % sahharoosi
sisaldab vask(II)triloon B kompleksi. Kompleks moodustub CuSO4 ja triloon B ekvimoraalsete hulkade ühendamisel. Kuna invertaasi toimeks on optimaalne happeline keskkond, siis toimub reaktsiooniproduktide määramiseks vajalik leeliseline komplekslahus invertaasile inhibeerivalt ja lõpetab ensüümiraktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetud taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. 1 Reaktsioonil vabanenud triloon B kogus määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust. Tiitrimisel toimub reaktsioon: Tiitrimiseks kulunud CuSO4 hulga järgi leitakse taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivus avaldatakse tahke preparaadi korral mikrokatalites 1 g kohta
Tiitrimisel toimuv reaktsioon on järgmine: Töö käik Valmistasin töölahust, selleks kaalusin 0,0151 g tahket invertaasi preparaati ja segasin 5 ml atsetaatpuhvriga, mille pH oli 4,8. 15 ml tuubi pipeteerisin 10 ml 7% sahharoosi lahust atsetaatpuhvris (pH 4,8) . Tuub suleti korgiga ning asetati vesitermostaati 30 oC juurde umbes 10 minutiks. Võetsin kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin igasse 10 ml komplekslahust. Kolbidesse viiakse reaktsioonisegust (=hüdrolüüsisegust) kindlatel aegadel võetud proovid, et neis määrata taandavate suhkrute sisaldust. Kui substraat on termostaadis saavutanud temperatuuri 30ºC, lisasin sellele 0,4 ml invertaasi töölahust ja loksutasin. Kohe peale reaktsioonisegu läbiloksutamist võetakse sellest pipetiga 1 ml lahust ja viiakse ühte kolbidest, kus on komplekslahus. Reaktsioonisegu tuub panin termostaati tagasi ja käivitasin stopperit. 10 ja 20 minuti pärast kordusin seda.
On polümeerid, mille põhiahelas kordub amiidrühm (-CO-NH-) Võib moodustuda aminohappe molekulide kui monomeeride polükondensatsioonil. Tööstuslikud polüamiidid e. nailonkiud ei ole eriti õhku läbilaskvad, seega pole sellest materjalist rõivad väga tervislikud. Samuti pole nailon eriti kuumuskindel ja ta lahustub mõningates orgaanilistes lahustites. Polüamiide saab toota ka pöördreaktsioonil happest ja amiinist vesikeskkonnas, ent selleks tuleb kõrvaldada pidevalt vett reaktsioonisegust. Protsessi kiirendab ka rõhu ja temperatuuri tõstmine. Valmistatakse ka kevlarkiudu millest tehakse kuulindlaid veste.
mis sisaldab vask(II)triloon B kompleksi. Kompleks moodustub CuSO4 ja triloon B ekvimoraalsete hulkade ühendamisel. Kuna invertaasi toimeks on optimaalne happeline keskkond, siis toimub reaktsiooniproduktide määramiseks vajalik leeliseline komplekslahus invertaasile inhibeerivalt ja lõpetab ensüümiraktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetud taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Reaktsioonil vabanenud triloon B kogus määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust. Tiitrimisel toimub reaktsioon, kus vabanenud triloon B komplekseerub uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi.
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsi uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega mittesadenevaid hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilistel meetoditel. Reaktsioonil võetud proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Kasutades olemasolevaid kalibrimissirgeid leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine · Pidin valmistama 5 mL lahust kontsentratsiooniga 1,5 mg/mL. Minu poolt uuritavaks proteaasi preparaadiks oli Alcalase. Kaalusin analüütilisel kaalul 7,1 mg uuritavat proteaasi ja viisin selle kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi. Järgnevalt lisasin uuritavale ainele boraatpuhvrit (pH=8,4), esialgu väiksema koguse.
Sama operatsiooni kordan veel 2 korda, s.t. ensüümireaktsiooni 10-ndal ja 15-ndal minutil. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine Proovidega katseklaasit jätan 15 minutiks sademe formeerumiseks. Sel ajal panen valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning varustan neid väikeste plastlehtrite ning paberfiltritega. 15 minuti pärast filtrin kuivadesse katseklaasidesse. Saadud filtraadid on täiesti selged. Spektrofotomeetril määran nelja, erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel = 280 nm (D280), kasutades 1 cm läbimõõduga kvartsküvette. Minu tulemused: I. 0,310 A II. 0,436 A III. 0,523 A IV. 0,747 A Kaliibrimisgraafikult leian vastavalt proovide optilise tiheduse väärtustele neis sisalduva türosiini kontsentratsioon. Türosiini kontsetratsioon: I. C = 0,049 mg/ml II. C = 0,069 mg/ml III. C = 0,083 mg/ml IV. C = 0,119 mg/ml
lähtepöördenurk(alghetke t = 0 väärtus) . Seejärel valatakse lähtelahus polameetri torust välja ja puhastatakse see. Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi katseklaasis 25 ml-le määratletud kontsentratsiooniga (näiteks 0.1M kuni 0,00625M)) suhkru lahusele 1 ml ensüümi (invertaas), ning koheselt fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg, käivitades stopperi. Loputataksepolarimeetri toru ja täidetakse (mullideta) reaktsioonisegust võetud prooviga. Toru asetatakse polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka, seades analüsaatori poolvarjuasendisse (või automaatselt polarimeetriga POLAMAT). Esimese mõõdetud nurga võetakse polarisatsioonitasandi pöördenurgaks lühimal ajahetkel, mis võimalik. Edasi teostatakse mõõtmiseid kindla ajavahemiku tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida aeg edasi, seda harvemini). Viimase lugemi
Vask(II)-triloon B kompleks täidab vaadeldava meetodi puhul kahesugust rolli: · tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mille pHopt 4,8, inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni. · tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)- triloon B kompleksi. Hüdrolüüsisegust võetud, taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta. (kat/ml). Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Valmistan 10 ml töölahust tahkest invertaasist, kontsentratsiooniga 5mg/ml.Lahustina kasutan
spektrofotomeetrilise meetodi kasutades. · Aromaattuuma omavad aminohapped ( Tyr, Phe, Trp) omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkusel 270-280 nm, siis väljendatakse kasieiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentatsioonina mg/ml ja kasutades kaliibrimisgraafikut leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik. · Valmistame proteaasi preparaadist lahuse valmistamine.(Alkalaas) Peab olema sobiv pH (meie juhul aluliseline). Lahuse ensüümi kontsentratsioon on 1,6 mg/ml . Paneme gradueeritud katseklaasi 8 mg ensüümipreparaadi ja lisame puhverlahust 5 milliliitrini. · Võtame suur 50 ml katseklaas ja pipeteerime 25 ml 2%-list kaseiini lahust. Klaas asutatkse vesitermostaati 30C juurde 10 minutiks soojenema.
(alghetke t = 0 väärtus) . Seejärel valatakse lähtelahus polameetri torust välja ja puhastatakse see. Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi katseklaasis 25 ml-le määratletud kontsentratsiooniga (näiteks 0.1M kuni 0,00625M)) suhkru lahusele 1 ml ensüümi (invertaas), ning koheselt fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg, käivitades stopperi. Loputatakse polarimeetri toru ja täidetakse (mullideta) reaktsioonisegust võetud prooviga. Toru asetatakse polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka, seades analüsaatori poolvarjuasendisse (või automaatselt polarimeetriga POLAMAT). Esimese mõõdetud nurga võetakse polarisatsioonitasandi pöördenurgaks lühimal ajahetkel, mis võimalik. Edasi teostatakse mõõtmiseid kindla ajavahemiku tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida aeg edasi, seda harvemini). Viimase lugemi võtmisel
kompleksomeetrlist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldas vask (II)-triloon-B kompleksi. Komplekslahus täidab aktiivsuse määramisel kaht rolli: 1. Tänu aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mille pH opt = 4,8, inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümreaktsiooni 2. Tagab vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon-B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov viiakse kompleklahusesse. Kompleksis sisalduv Cu(II) taandub keemistemperatuuril Cu(I)-ks ja moodustub vask(II)oksiid. Cu2O eraldub punase sademena. Alles jääb ekvivalentses koguses vaba triloon-B. Vabanenud triloom-B kogus määratakse tiitrimise teel. Tiitrimiseks kasutatakse 0,02 M vasksulfaadi lahust. Protsessi käigus komplekseerub triloon-B uuesti Cu (II) ioonidega. Lahusesse lisatud indikaator mureksiid muutub rohekaks, kui vastav kompleks on tekkinud.
Aromaatse tuumaga aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270-280 nm ja seetõttu saab neid hästi detekteerida spektrofotomeetriliselt. Proovides mõõdetakse kindlal lainepikkusega valguskiirguse neelduvust. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml. Kasutades kaliibrimissirget saadakse optiliste tiheduste kaudu türosiini kontsentratsioon kindlatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proovidel. 2. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Uuritavast proteaasi preparaadist, milleks antud töös oli savinaas, valmistati ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, mille kontsentratsioon oli 1,5 mg/ml. Arvutasin savinaasi kaalutise suuruse, milleks oli 0,0075 grammi. Kaalusin analüütilistel kaaludel antud koguse ning tegin lahuse gradueeritud 5 milliliitrise mahuga katseklaasi. Esialgu
sisaldab vask(II)triloon B kompleksi. Kompleks moodustub CuSO4 ja triloon B ekvimoraalsete hulkade ühendamisel. Kuna invertaasi toimeks on optimaalne happeline keskkond, siis toimub reaktsiooniproduktide määramiseks vajalik leeliseline komplekslahus invertaasile inhibeerivalt ja lõpetab ensüümiraktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetud, taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta. (µkat/ml). Töö käik 1. Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks võetakse 50 ml katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml 7%-
triloon B kompleksi. Kompleks valmistatakse Na 2CO3 lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA-Na –d (etüleen-diamiintetraäädikhappe dinaatriumi sool). Kuna see lahus on tugevalt aluseline ning invertaasi optimaalne pH on 4,8, siis mõjub see lahus inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni. Samuti on taandavate suhkrute määramiseks vajalik leeliseline keskkond ja vask(II)-triloon B kompleks. Reaktsioonisegust kindlal ajahetkel võetud proov, mis sisaldab taandavaid suhkruid viiakse komplekslahusesse. Keemisel taandub kompleksis sisalduv vask(II) suhkrute toimel vask(I)-ks. Seejärel moodustub Cu 2O, seda on näha punase sademena, mis tekib sinise lahuse põhja. Ekvivalentses koguses jääb lahusesse vaba triloon B. Vabanenud triloon B tiitritakse 0,02 M vasksulfaadi lahusega. Stöhhiomeetrilise punkti määramiseks lisatakse indikaatorina mureksiidi, mis värvub selles punktis roheliseks.
annaabi.ee 
