Biokeemia protokoll - Proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse määramine (0)

Tallinna Tehnikaülikool - Keemia - Biokeemia

5 VÄGA HEA

3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Kaisa Rahuoja
093421 KATB-41
Tallinna tehnikaülikool
Matemaatika-loodusteaduskond
Keemiainstituut

Proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse määramine
Kaisa Rahuoja
093421 KATB- 41

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Teooria
Proteolüütilised ensüümid e. proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alustades toiduvalkude seedimisest ja lõpetades väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadidega
Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH ≅ 2,5), neutraalseid (pH ≅ 7,2) ja leelisproteaase (pH ≅ 9,0).
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.
Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust , tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või μmol /ml (1 μmol = 181μg = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides.
Töö käik
Kaalusin 0.005 g tahke proteaasi (amülaasi) preparaati, valasin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin vajaliku koguse puhvrit, et lahuse üldmaht oleks 5 ml Segasin lahust proteaasi lahustumiseks 5 minuti vältel.
Samal ajal pipeteerisin suurde katseklaasi 25 ml 2% kaseiini lahust ning panin selle 10 minutiks termostaati 30 kraadi juurde soojenema.
Sel ajal, kui kaseiini lahus termostaadis soojenes, võtsin 4 katseklaasi, nummerdasin ning pipeteerisin igaühte 3 ml 5% trikloroäädikhapet. Kolbidesse lisasin ettenähtud aegadel reaktsioonisegust võetud proovi.
Kui termostaadis olev lahus oli piisavalt soojenenud, lisasin sellele 1 ml proteaasilahust, loksutasin korralikult ja kiiresti ning võtsin reaktsioonisegu ml segu ning pipeteerisin selle esimesse nummerdatud katseklaasi TKÄ-ga. Fikseerisin reaktsiooni algusaja. (0-proov) Sarnaselt toimisin veel 10 ja 20 minuti möödumisel reaktsiooni fikseeritud algusest.
Täpselt 5 minuti möödumisel võtan taas reaktsioonisegu termostaadist ja pipeteerin 3 ml lahust teise TKÄ-ga täidetud katseklaasi. Asetan reaktsioonisegu taas termostaati. Sama protseduuri kordan veel reaktsiooni kulgemise 10ndal ja 15ndal minutil.
Pärast ensüümisegu lisamist loksutan katsaeklaasid kiirelt läbi, et tekkiva sademe osakesed oleksid väiksemad. Jätan sademe formeeruma ja alla vajuma, kuni katseklaas, kuhu lisasin ensüümisegu viimasena, on seisnud juba 15 minutit.
Samal ajal panen valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi, nummerdan need ning varustan plastmasslehtri ja filterpaberiga. Sobiva aja möödudes alustan filtrimist . Jälgin, et saadav filtraat oleks selge, mitte hägune. Juhul, ku lahus on hägune, tuleb seda uuesti filtrida.
Määran nelja filtraadi optilise tiheduse spektrofotomeetril lainepikkusel 280 nanomeetrit. 2
Vastavalt optilise tiheduse väärtusele leian kalibreerimisgraafikult proovides sisalduva türosiini kontsentratsiooni. Katseandmete põhjal koostatakse graafik . Jälgitakse, et see moodustaks ühtlase sirge.
Andmed
Türosiini kontsentratsioon C (mg)
0.0049
0,0029
0,0027
0,0053
Graafik on illustratiivne, sest empiiriline graafik ei andnud rahuldavaid tulemusi.
Arvutus: A = ΔCTyr • 103 • V1 • V2 • 2 / Δt • 181 • V3 • g
A1 = (0,0049-0,0029)*1000 * 26 * 5 * 2/ 300 * 181 * 1 *0,0051 = 1,878 μkat/g
A2 =0,9930 μkat/g
A3 = 0,1204 μkat/g
Katseandmed peaksid tulema sarnased, paraku aga on erinvus liiga suur. Võimalikud põhjused, miks katse ei õnnestunud, on toodud kokkuvõttes.
Kokkuvõte ja järeldused
Teoreetiliselt peaksid katses saadud türosiini kontsentratsioonid graafikul kanduma ühele sirgele.
Käesoleva katse empiirilised andmed aga teoreetiliste seisukohtadega kokku ei lange. Selle põhjuseks võivaderrtrttr eelkõige olla:

proteolüütilise ensüümi tahke preparaadi vähene lahustumine puhvris
Mitte piisavalt kiire tegutsemine proteaasi lisamisel kaseiinile ning sealt proovi eraldamine
Ebatäpsus proovide võtmise ajastamisel.
Ebapiisav proovide segamine pärast reaktsioonisegu lisamist, mistõttu moodustunud sade klimbistus ning nii selle sadestamine kui filtrimine oli raskendatud.
Ebatäpsused filtrimisel- eelmistes etappides tehtud eksimuste tõttu oli mõnel katsel filtraati liiga vähe ning lahuse optilise tiheduse määramine spektrofotomeetril ei pruukinud olla adekvaatne.

Kõiki eelnevaid võimalusi arvestades võis kujuneda katseviga , mistõttu katse empiirilised andmed erinevad suurel määral teoreetilistest .

.ODT Laadi alla originaalfail 4 lk · .odt · 157 allalaadimist

Biokeemia protokoll - Proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse määramine #1

Biokeemia protokoll - Proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse määramine #2

Biokeemia protokoll - Proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse määramine #3

Biokeemia protokoll - Proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse määramine #4

50 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 50 punkti.

~ 4 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2012-02-28 Kuupäev, millal dokument üles laeti

157 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

karull Õppematerjali autor

Teoreetiliselt peaksid katses saadud türosiini kontsentratsioonid graafikul kanduma ühele sirgele.

Käesoleva katse empiirilised andmed aga teoreetiliste seisukohtadega kokku ei lange. Selle põhjuseks võivaderrtrttr eelkõige olla:
• proteolüütilise ensüümi tahke preparaadi vähene lahustumine puhvris
• Mitte piisavalt kiire tegutsemine proteaasi lisamisel kaseiinile ning sealt proovi eraldamine
• Ebatäpsus proovide võtmise ajastamisel.
• Ebapiisav proovide segamine pärast reaktsioonisegu lisamist, mistõttu moodustunud sade klimbistus ning nii selle sadestamine kui filtrimine oli raskendatud.
• Ebatäpsused filtrimisel- eelmistes etappides tehtud eksimuste tõttu oli mõnel katsel filtraati liiga vähe ning lahuse optilise tiheduse määramine spektrofotomeetril ei pruukinud olla adekvaatne.
Kõiki eelnevaid võimalusi arvestades võis kujuneda katseviga, mistõttu katse empiirilised andmed erinevad suurel määral teoreetilistest.

biokeemia proteolüütilised ensüümid labor protokoll

Sarnased õppematerjalid

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Keemiainstituut TTÜ Bioorgaanilise Keemia õppetool Töö nr 3.2 Töö pealkiri Proteolüütiliste Juhendaja Tiina Randla ensüümide aktiivsuse määramine Üliõpilane Õpperühm KATB41 Töö teostatud 16/03/2012 Arvestatud Teooria Proteolüütilised ensüümid e. proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude

Biokeemia

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool Viktoria Dolgova 121146 KATB 3.2 PROTEOLÜÜTILISTE ENSÜÜMIDE AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Laboratoorsed tööd Juhendaja: Tiina Randla Teoreetilised alused Proteolüütilised ensüümid e. proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides. Neis leidakse kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alustades toiduvalkude seedimisest ja lõpetades väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadidega Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0).

Biokeemia

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL Õppeaine YKL0063 Biokeemia PRAKTIKUM: Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Üliõpilane: Juhendaja: Kood: Esitatud: Sooritatud: 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIVSUSE MÄÄRAMINE Teooria Proteolüütilised ensüümid e. proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alustades toiduvalkude seedimisest ja lõpetades väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadidega Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid: Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2 Pro)

Biokeemia

docx

3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine - Biokeemia labori protokoll

Tallinna Tehnikaülikool 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Biokeemia labori protokoll 2011 Töö teoreetilised alused Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides. Seejuures nad produtseerivad madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase on kõikides organismides, sest nad täidavad füsioloogilisi funktsioone, sealhulgas katalüüsides toiduvalkude seedimist ja kõrgeltreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaade. Proteolüütiliste ensüümide esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Osa lõhustavad

Biokeemia

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL Keemia instituut Bioorgaanilise keemia õppetool Biokeemia praktikumi laboratoorne töö 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Üliõpilane: Liis Hendrikson Matrikli nr: 104191 Õpperühm: KATB 41 Juhendaja: Tiina Randla 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Töö teoreetilised alused: Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (ka proteinaasid või peptidaasid) on ensüümis, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises (nt vere hüübimise kaskaad).

Biokeemia

pdf

3.2 Proteaas

Tallinna Tehnikaülikool YKL0060 Biokeemia Töö nr 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Yasb 21 Juhendaja Tiina Randla 20.04.2012 Teooria Proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, sest nende ülesanded ulatuvad alates toiduvalkude seedimisest kuni väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadideni nt vere hüübimise kaskaad. Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Piiratud

rekursiooni- ja keerukusteooria

docx

3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (EC 3.4.4) on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassida peptiide ja vabu aminohappeid. Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid: · Trüpsiin (R1 = Lys, Arg; R2 Pro)

Biokeemia

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool Biokeemia Laboratoorne töö 3.2 Teostaja: 2016 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid, on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke. Erinevad proteaasid omavad ka erinevat toimespetsiifikat. Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs).

Biokeemia

Rohkem sarnaseid