Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (1)

TTÜ
Keemiainstituut
Bioorgaanilise Keemia õppetool
Töö nr
3.2
Töö pealkiri
Proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse määramine
Juhendaja
Tiina Randla
Üliõpilane
Õpperühm
KATB41
Töö teostatud
16/03/2012
Arvestatud
Teooria
Proteolüütilised ensüümid e. proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alustades toiduvalkude seedimisest ja lõpetades väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadidega
Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0).
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.
Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või μmol /ml (1 μmol = 181μg = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides.
Töö käik
Kaalusin 0.02 g tahke proteaasi ( esperaas ) preparaati, valasin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin vajaliku koguse puhvrit, et lahuse üldmaht oleks 5 ml. Segasin lahust proteaasi lahustumiseks 5 minuti vältel.
Samal ajal pipeteerisin suurde katseklaasi 25 ml 2% kaseiini lahust ning panin selle 10 minutiks termostaati 30 kraadi juurde soojenema.
Sel ajal, kui kaseiini lahus termostaadis soojenes, võtsin 4 katseklaasi, nummerdasin ning pipeteerisin igaühte 3 ml 5% trikloroäädikhapet.
Kui termostaadis olev lahus oli piisavalt soojenenud, lisasin sellele 1 ml proteaasilahust, loksutasin korralikult ja kiiresti ning võtsin reaktsioonisegu ml segu ning pipeteerisin selle esimesse nummerdatud katseklaasi TKÄ-ga. Fikseerisin reaktsiooni algusaja. (0- proov )
Täpselt 5 minuti möödumisel võtan taas reaktsioonisegu termostaadist ja pipeteerin 3 ml lahust teise TKÄ-ga täidetud katseklaasi. Asetan reaktsioonisegu taas termostaati. Sama protseduuri kordan veel reaktsiooni kulgemise 10ndal ja 15ndal minutil.
Pärast ensüümisegu lisamist loksutan katsaeklaasid kiirelt läbi, et tekkiva sademe osakesed oleksid väiksemad. Jätan sademe formeeruma ja alla vajuma, kuni katseklaas , kuhu lisasin ensüümisegu viimasena, on seisnud juba 15 minutit.
Samal ajal panen valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi, nummerdan need ning varustan plastmasslehtri ja filterpaberiga. Sobiva aja möödudes alustan filtrimist . Jälgin, et saadav filtraat oleks selge, mitte hägune. Juhul, ku lahus on hägune, tuleb seda uuesti filtrida.
Määran nelja filtraadi optilise tiheduse spektrofotomeetril lainepikkusel 280 nanomeetrit. 2
Vastavalt optilise tiheduse väärtusele leian kalibreerimisgraafikult proovides sisalduva türosiini kontsentratsiooni. Katseandmete põhjal koostatakse graafik . Jälgitakse, et see moodustaks ühtlase sirge.
Andmed
Türosiini kontsentratsioon C (mg)
0.022
0,033
0,05
0,069
Graafik on illustratiivne, sest empiiriline graafik ei andnud rahuldavaid tulemusi.
Arvutus: A = ΔCTyr • 103 • V1 • V2 • 2 / Δt • 181 • V3 • g
A1 = (0,069-0,022)*1000 * 26 * 5 * 2/ 916 * 181 * 1 *0,02 = 3,68 μkat/g
A2 =3,56 μkat/g
A3 = 3,44 μkat/g
Katseandmed tulid sarnased, katse võib lugeda õnnestunuks.
Kokkuvõte ja järeldused
Teoreetiliselt peaksid katses saadud türosiini kontsentratsioonid graafikul kanduma ühele sirgele.
Käesoleva katse empiirilised andmed erinevad veidi . Selle põhjuseks võivade eelkõige olla:

• proteolüütilise ensüümi tahke preparaadi vähene lahustumine puhvris
  
• Mitte piisavalt kiire tegutsemine proteaasi lisamisel kaseiinile ning sealt proovi eraldamine
  
• Ebatäpsus proovide võtmise ajastamisel.
  
• Ebapiisav proovide segamine pärast reaktsioonisegu lisamist, mistõttu moodustunud sade klimbistus ning nii selle sadestamine kui filtrimine oli raskendatud.
  
• Ebatäpsused filtrimisel- eelmistes etappides tehtud eksimuste tõttu oli mõnel katsel filtraati liiga vähe ning lahuse optilise tiheduse määramine spektrofotomeetril ei pruukinud olla adekvaatne.
  

Kõiki eelnevaid võimalusi arvestades võis kujuneda katseviga , mistõttu katse empiirilised andmed erinevad teoreetilistest .