Biokatalüüs, proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (0)

Laboratoorne töö nr: 2
Töö pealkiri:
Biokatalüüs, proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Õpperühm:
YASB21 C
Üliõpilane:
Ilona Juhanson , 123964YASB
Juhendaja :
Tiina Randla
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsideme hüdrolüüsi, mille tagajärjel saadakse madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid . Proteaase leidub kõigis organismides ning nad osalevad paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alates seedimisest ning lõpetades kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonidega (nt vere hüübimine).
Proteaasidel on erinev toimespetsiifika. Mõned lõhustavad eelistatult vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad üldisemalt (piiramatu proteolüüs).
Piiratud proteolüüsi proteaasid:
- Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2=/ Pro)
- Kümotrüpsiin (R1= Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2=/ Pro)
- Pepsiin (R1= Phe, Leu, jpt; R2=/ Pro)
Ühtlasi ka endopeptidaasid.
Eristatakse endo - ja eksopeptidaase sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib ahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele.
Eksopeptidaasideks on karboksüpeptidaasid (R2= C- terminaalne aminohape ) ja aminopeptidaasid (R1= N-terminaalne aminohape), mis lühendavad peptiide ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid vabastades.
Optimaalne pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH~2,5), neutraalseid (pH~7,2) ja leelisproteaase (pH~9,0).
Aktiivtsentri ehitusest, millised aminohapped sinna kuuluvad, tuleneb ensüümi toimemehhanism.
Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 mikrokat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 mikromooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 miksomooli aminohapete vabanemist 1 sekundi vältel 30 kraadi juures Celsiuse järgi.
Proteaase aktiivsust avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate aminohapete/peptiidide hulga kaudu, kuna peptiidsidemete hulk pole otseselt mõõdetav.
Neutraalsed ja aluselised proteaasid:
- substraadina kaseiin (piima põhivalk, fosfoproteiin). Jälgitakse hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud sidemed. Sisalduvad peamiselt pika ahelaga peptiide. Valdav osa valgust on hüdrolüüsumata ning tekkinud on vaid vähesel määral proteolüüsi produkte.
Proteaase aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.
Tervikvalgud ja kõrgmolekurlaarsed peptiidid , mille molekulmass >10000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis ühtlasi inaktiveerib ensüümi ning peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel (nt türosiin, fenüülalaniin, trüptofaan). Neeldusmismaksimumid UV-piirkonnas asuvad lainepikkustel 270-280 nm, mistõttu on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad.
Reaktsionisegu proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust ehk optilist tihedust (D)/absorptsiooni (A). Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või mikromooli/ml (1 mikromool = 181 mikrogrammmi = 0,181 mg), kuigi lahuses võib olla ka teisi aromaatse tuumaga aminohappeid. Antud kaliibrimissirge abil leitakse A väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides.
Töö käik
Töölahuse valmistamine:
Valmistada uuritavast proteaasi preparaadist ensüümile sobiva pH-ga puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon on vahemikus 1-5 mg/ml. Arvutada välja ensüümipreparaadi kaalutise suurus. Vajalik kogus ensüümpreparaati viia kadudeta lahuse valmistamiseks sobivasse anumasse , lisada väike kogus puhverlahust ning segada klaaspulgaga umbes 5 minutit, kuni ensüüm on lahustunud. Selget lahust ei teki, kuna preparaadis sisaldub lahustumatu täiteaine. Täita klaas puhverlahusega ettenähtud mahuni ja loksutada läbi, ühtlustamaks ensüümi kontsentratsiooni.
Pipeteerisin 50 ml-lisesse katseklaasi 25 ml 2%-list kaseiini lahust, pH=8,4. Ensüümikontsentratsioon 1,5 mg/ml. Vajalik kogus=1,5*5=0,0075g.
Hüdrolüüs:
1. 50 ml katseklaasi pipeteerida 25 ml 2%-list kaseiini lahust, millel on sobiv pH. Katta korgiga ja asetada vesitermostaati 30 kraadi juurde Celsiuse järgi 5-10 minutiks soojenema.
2. Võtta 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja need nummerdada. Igaühte pipeteerida 3 ml 5%-list TKÄ lahust.
3. Alustada ensüümireaktsiooni kui kaseiini lahus on 30 kraadini soojenenud. Pipeteerida kaseiinile juurde 1 ml proteaasi (sarinaas) töölahust, loksutada kiiresti läbi ja asetada termostaati tagasi. Fikseerida aeg kellaga või käivitada stopper . Võtta 0 proov : 3 ml reaktsioonisegu lisada esimesse TKÄ-ga katseklaasi ning loksutada kiiresti läbi. Kaseiini ja proteaasiga katseklaas panna kiiresti tagasi termostaati.
Kell: 9:19
4. Viie minuti pärast võtta sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ning loksutada hoolega. Korrata veel kaks korda 5-minutiliste intervallidega, st 10. minutil ja 15. minutil.
Kell: 9:24, 9:26-9:31, 9:32-9:37,
Proovidega katseklaasid jätta sademe formeerumiseks 10-15 minutiks seisma. Seejärel panna valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi, varustada need väikeste plastik /klaaslehtrite ning paberfriltriga.
Settinud sademega proovid filtrida, kuni lahus on täiesti selge.
Esimest 0-lahust filtrisin kaks korda, kuid kuna hilisem spektrofotomeetriline mõõtmine ei andnud sellele proovile ainsana õiget tulemust, siis arvan, et oleks pidanud kolmandat korda filtrima.
Spektrofotomeetril määratakse nelja, erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel lamba=280 nm (D280), kasutades 1 cm läbimõõduga kvartsküvette.
mõõtmistulemus
Ctyr mg/ml
I: x
x
II: 0,219
0,035
III: 0,312
0,049
IV: 0,419
0,066
Mõõtmisel saadud türosiini kontsentratsioonid on väga sarnase vahekaugusega.
0,066-0,049=0,017
0,049-0,035=0,014
Järelikult suureneb iga viie minuti järel türosiini kontsentratsioon sarnaselt eelmistele vahemikele. Võimalik pisikene erinevus võib tuleneda sellest, et neljanda proovi võtmisele eelnenud lahus võis olla termostaadis natuke kauem, kui kolmanda või teise puhul.
Hoida tuleb krobelisestest/ähmastest pooltest, kuna muidu võivad läbipaistvad pooled määrduda ja mõõtmistulemust mõjutada.
Katseandmete ja kaliibrimisgraafikult leitud türosiini kontsentratsiooni alusel koostatakse graafik , mis väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr=f(t).
Kuna proovid on reaktsioonisegust võetud kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis, mil produktide kontsentratsiooni ja ajal vahel valitseb lineaarne sõltuvus, siis peavad kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul langema sirgele, mis ei läbi koordinaatide alguspunkti, kuna 0-proov võib sisaldada veidi türosiini (kaseiinis sisaldub vähesel määral TKÄ-ga mittesadenevaid komponente).
Katsepunktide hajumise korral viia neist läbi kõiki punkte arvestav sirge, misjärel leitakse türosiini juurdekasv delta CTyr valitud ajavahemikus delta t.
Ensüümiks oli sarinaas.
A=mikrokat/g
∆Ctyr=0,049 – 0,035=0,014
∆t=10-5=5
V1=26
V2=5
V3=1
m=0,0075g
A=(0,014*103*26*5*2)/(5*181*1*0,0075)=536,28 mikrokat/g=5,3628*10-4kat/g
∆Ctyr=0,066-0,049=0,017
∆t=15-10=5
V1=26
V2=5
V3=1
m=0,0075g
A=(0,017*103*26*5*2)/(5*181*1*0,0075)=651,197 mikrokat/g=6,512*10-4 kat/g
Aktiivsust ehk katalüütilist jõudu võib iseloomustada katalüütilise ja mittekatalüütilise reaktsiooni kiiruste suhtega, mis on vahemikus 107...1014, enamasti on ensüümid anorgaanilistest katalüsaatoritest 105...106 korda aktiivsemad.
Ensüümi kogust väljendatakse tihti aktiivsusena, st tema poolt esilekutsutava katalüütilise efekti järgi ehk ühes ajaühikus produktideks konverteeritud substraadi moolide arvu/tekkinud produktide moolide arvu järgi.
Ühik: 1 katal (kat)= 1 mol* s-1
Üks katal on selline ensüümi hulk, mis konverteerib 1 sekundi jooksul ensüümile optimaalsetel tingimustel 1 mooli substraati reaktsiooniproduktideks.
1 mkat=10-3 kat
1 mikrokat=10-6 kat
1 nkat=10-9 kat
Levinud on ka aktiivsuse väljendamine rahvusvahelistes ühikutes IU-des (International Units).
1 IU = 1 mikromool minuti kohta
1 IU on selline ensüümi hulk, mis katalüüsib 1 minuti jooksul 25 kraadi juures ensüümile optimaalsetel tingimustel 1 mikromooli substraadi konversiooni reaktsiooniproduktideks.
Kui toimimiseks optimaalne 25 kraadi,
siis 1kat=6*107 IU, ehk 1 IU=16,67 nkat