Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Sugar, Plum

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (0)

Keemia - Keemia

5 VÄGA HEA

3 Biokatalüüs

3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

3.2.1 Töö teoreetilised alused

PROTEOLÜÜTILISED ENSÜÜMID – (e proteaasid , proteinaasid, peptidaasid) - ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsideme hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, mille tulemusel tekivad madalam molekulmassiga peptiidid ja vabad aminohapped .
PROTEOLÜÜS – protsess, mille käigus proteaasid katalüüsivad peptiidsideme hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides
Proteaaside funktsioonid: (füsioloogilised funktsioonid)

Toiduvalkude seedimine
Kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadid (vere hüübimise kaskaad )

Joonis 1. Endopeptidaasi eelistatud toimumispunkt.
Piiratud proteolüüsi läbiviivad ensüümid:

Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2≠ Pro
Kümotrüpsiin (R1=Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2≠Pro)
Pepsiin (R1=Phe, Leu jpt; R2≠Pro)

+ bakteriaalsed proteaasid (subtilisiin, savinaas, alkalaas )
Tabel 1. Piiratud proteolüüsi läbiviivad ensüümid
ENDOPEPTIDAAS – ensüüm, mis toimib polüpeptiidahele kesksetele peptiidsidemetele (nt trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, alkalaas, subtilisiin, savinaas)
EKSOPEPTIDAAS – ensüüm, mis toimib polüpeptiidahele otsmistele peptiidsidemetele. Nad lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid (nt karboksüpeptidaasid R2=C- terminaalne aminohape ja aminopeptidaasid R1=N-terminaalne aminohape)
Ensüümi toimimiseks optimaale pH väärtuse järgi eristatakse järgmisi ensüüme:

HAPU PROTEAAS – ensüüm, mis toimib, kui pH2,5

NEUTRAALNE PROTEAAS – ensüüm, mis toimib, kui pH7,2

LEELISPROTEAAS – ensüüm, mis toimib, kui pH9,0
Aktiivtsentri ehitus ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism on oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks. Selle põhjal saab välja tuua neli peamist rühma:

Seriinproteinaasid

Tioolproteinaasid

Aspartaatproteinaasid

Metallproteinaasid
Hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, mistõttu avaldatakse proteaaside aktiivsus valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide (amh-e ja peptiidide hulga) kaudu:
ENSÜÜMI PROTEOLÜÜTILISE AKTIIVSUSE ÜHIK:
1 μkat- ensüümi hulk, mis põhjustab 1 μmooli peptiidsideme hüdrolüüsi/ 1 μmooli aminohapete vabanemisel 1 sekundi vältel 30°C juures
Tabel 2. Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühik
Uuritavad preparaadid erinevad substraadispetsiifilisuse ja optimaalse pH väärtuse poolest:
Proteaasi preparaat ja vajalik pH
Substraat , mida kasutatakse proteaasi aktiivsuse määramisel
NEUTRAALSED JA ALUSELISED PROTEAASID
Kaseiin : piima põhivalk, mis koostiselt fosfoproteiin. Kaseiini molekulid on väga hüdrofoobsed, kuid kaseiini Na-sool hüdrofiilne
Objektiivseks hindamiseks tuleb jälgida HÜDROLÜÜSI ALGSTAADIUMIT:

Valgu polüpeptiidahelas katkevad üksikud peptiidsidemed
Reaktsioonisegu sisaldab pika ahelaga peptiide
Märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata
Tekkinud on vähesel määral vabu amh-d ja madalmolekulaarseid peptiide

Tabel 3. Neutraalsete ja aluseliste proteaaside toimimise tingimused
Proteaasi aktiivsuse määramise põhineb:

kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel

TKÄ-ga mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määrmine spektrofotomeetrilisel meetodil
Miks?

Tervikvalkude ja kõrgmolekulaarsed peptiidid, mille Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel
TKÄ inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi
Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad amh-d ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni saab kaudselt iseloomustada aromaatset tuuma sisaldavate amh-te sisalduse alusel

Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped: Need amh-d omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270-280 nm. Seetõttu spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad.

Tyr (türosiin)

Trp (trüptofaan)

Phe (fenüülalaniin)
Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldust väjendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või μmol/ml (1 μmol= 181 μg=0,181 mg).
Kui kasutada kaliibrimissirget A vs CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides.
Joonis 2. Aromaatset tuuma sisaldavate amh-te neeldumisspektrid

3.2.2 Töö käik

ENSÜÜMPREPARAADIST TÖÖLAHUSE VALMISTAMINE:

Valmista uuritavast protaasi preparaadist (ALKALAAS) ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus.
NB! Ensüümi kontsentratsioon olgu vahemikus 1-5 mg/ml

Kooskõlasta juhendajaga:

Alkalaasile sobiv puhver Boraatpuhver, pH= 8,4
Lahuse täpne maht 5 ml
Alkalaasi kontsentratsioon lahuses 1,66 mg/ml

Arvuta ensüümpreparaadi kaaluklaasi vajalik kogus ensüümpreparaati (analüütiline kaal):

Kaalu sobiva suurusega kaaluklaasi vajalik kogus (8,3 mg) alkalaasi.

Vii kadudeta (kvalitatiivselt) preparaat lahuse valmistamiseks sobivasse anumasse (gradueeritud katseklaas ).

Lisa väike kogus puhverlahust ja sega klaaspulgaga minutit kuni alkalaasi lahustumiseni.
NB! Selget lahust ei teki, sest preparaadid sisaldava täiteainet! Samas suured klimbid peavad olema kadunud!

Täida klaas puhverlahusega etteantud mahuni ja loksuta läbi, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks.
ENSÜÜMREAKTSIOONI (KASEIINI HÜDROLÜÜSI) LÄBIVIIMINE:

Võta 50 ml mahuga suur katseklaas.

Pipeteeri 25 ml 2%-list kaseiini lahust. (Kaseiin on substraadiks )
NB! pH peab olema reguleeritud ensüümile sobiva väärtusega!

Kata klaas korgiga ja aseta vesitermostaati 30°C juures 5-10 minutiks soojenema.

Võta 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi. Nummerda katseklaasid!

Pipeteeri igaühte 3 ml 5%-list TKÄ lahust.

Kui kaseiini lahus on temperatuurini 30°C soojenenud, alusta elnsüümreaktsiooniga- KASEIINI HÜDROLÜÜSIGA!
NB! Fikseeri stopperiga reaktsiooni algusaeg!

Pipeteeri kaseiini juurde 1 ml valmistatud alkalaasi lahust.

Loksuta reaktsioonisegu kiiresti läbi ja aseta tagasi termostaati.

Võta kuiva pipetiga võimalikult kiiresti 3 ml reaktsioonisegu:

Vii reaktsioonisegu katseklaasi A, mis sisaldab 5%-list TKÄ-d. Tegu on 0-prooviga!

Loksuta klaasi sisu hoolega. NB! Ära mikserda!

Peale proovi võtmist aeta reaktsiooniseguga katseklaas termostaati.

Kui on möödas täpselt 5 minutit, võta sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu ja pane see katseklaasi B.

Korda sama katseklaaside C ja D-ga.

Võta katseklaas termostaadist välja.
REAKTSIOONIPRODUKTIDE SISALDUSE MÄÄRAMINE JA AKTIIVSUSE ARVUTAMINE:

Jäta katseklaasid 10- 15 minutiks seisma, et sade saaks täielikult formeeruda

Selle aja jooksul pane valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi:

Varusta need sobivate väikeste plastlehtritega.

Filtri proovid (milles sade põhja settinud) kuivadesse katseklaasidesse:

Filtrile jäänud sade pole vajalik
Filtraadid peavad olema selged. Kui hägused, tuleb uuesti filtreerida.

SPEKTROFOTOMEETRIA OSA:

Määra spektrofotomeetril 4 (erineval ajal reaktsioonisegust võetud) proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel

Kasuta 1 cm läbimõõduga kvartsküvette.

Leia kaliibrimisgraafikult vastavalt proovide optilise tiheduse väärtusele D280 neis sisalduva türosiini kontsentratsioon (mg/ml või μmol/ml)

KATSEKLAAS A: 0,340
KATSEKLAAS B: 0,373
KATSEKLAAS C: 0,485
KATSEKLAAS D: 0,596

Koosta graafik katseandmete alusel.
Mõõdetud optilise tiheduse väärtus
Vastav türosiini kontsentratsiooni väärtus
0,340
0,0540
0,373
0,0595
0,485
0,0765
0,596
0,0949
Tabel 4. Mõõdetud optilised tihedused ja nendele vastavad türosiini kontsentratsioonide väärtused
Sellele tabelile vastab graafik:
Joonis 3. Optilist tiheduse ja türosiini kontsentratsiooni vahelist sõltuvust kajastav graafik
Graafik väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust:
Joonis 4. Türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust kajastav graafik
Excelisse sisestasin tabeli:
Aeg (min)
0
5
10
15
C [Tyr]
0,054
0,0595
0,0765
0,0949
Tabel 5. Aja ja C[Tyr] vahelist sõltuvust väljendav tabel
ARVUTUSED:
kus
– türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavaheikus (mg/ml)
– hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s)
– reaktsioonisegu (substraat+ensüüm) üldmaht (ml)
– valmistatud alkalaasilahuse üldmaht (ml)
2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (3 ml⟹ 6 ml, seega L=2)
– alkalaasi maht hüdrolüüsisegus (ml)
g – alkalaasi graanulite kaalutis (g)
181 – türosiini molekulmass
Leian alkalaasi proteolüütilise aktiivsuse A (μkat/g):

3.2.3 Kokkuvõte ja järeldused

Uuritavaks proteaasiks oli alkalaas, mille aktiivsuseks 30°C ja 8,4 pH väärtuse juures oli 3,12 .
Kuna proovid on reaktsioonisegust võetud kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis, mil produktide kontsentratsiooni ja aja vahel valitseb lineaarne sõltuvus , siis peavad kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul langema sirgel. Sirge ei läbi koordinaatide alguspunkti, sest kaseiin sisaldab vähesel määral TKÄ-ga mittesadenevaid komponente ja seetõttu ka 0- proov sisaldab veidi türosiini. Põhjus, miks minu graafik pole lineaarne, võib peituda ebaselgetes lahustes: filtreerisin oma lahuseid 3-4 korda ning lõpetasin siis, sest vastasel juhul poleks enam olnud mõõtmistulemusteks materjali jätkunud. Siinkohal tuleb tunnistada, et minu filtrimisoskused võiksid olla tunduvalt paremad. Arvestada võib ka ajafaktorit: nagu eespool selgus, peab graafik olema lineaarne produktide kontsentratsioonide ja aja lineaarse sõltuvuse tõttu; ilmselt ei tegutsenud ma piisavalt kiiresti ning aeg ei ole konstantne (täpselt 5, 10, 15... minutit).

.DOCX Laadi alla originaalfail 6 lk · .docx · 23 allalaadimist

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine #1

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine #2

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine #3

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine #4

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine #5

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine #6

50 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 50 punkti.

~ 6 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2013-05-10 Kuupäev, millal dokument üles laeti

23 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

Plum Sugar Õppematerjali autor

Põhjalik protokoll, millel olemas korralik kokkuvõte, joonised, tabelid.

proteaas alkalaas boraatpuhver kaliibrimisgraafik tiina randla katseklaas proteaas kaseiin kontsentratsioon reaktsioonisegu

Sarnased õppematerjalid

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool Biokeemia Laboratoorne töö 3.2 Teostaja: 2016 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid, on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke. Erinevad proteaasid omavad ka erinevat toimespetsiifikat. Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs).

Biokeemia

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Biokeemia praktikum Laboratoorne töö nr.3.2 Anna Logunova YAGB-22 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Teooria Proteolüütilised ensüümid ehk on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides ,produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid

Biokeemia

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL Keemia instituut Bioorgaanilise keemia õppetool Biokeemia praktikumi laboratoorne töö 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Üliõpilane: Liis Hendrikson Matrikli nr: 104191 Õpperühm: KATB 41 Juhendaja: Tiina Randla 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Töö teoreetilised alused: Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (ka proteinaasid või peptidaasid) on ensüümis, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises (nt vere hüübimise kaskaad).

Biokeemia

pdf

3.2 Proteaas

Tallinna Tehnikaülikool YKL0060 Biokeemia Töö nr 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Yasb 21 Juhendaja Tiina Randla 20.04.2012 Teooria Proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, sest nende ülesanded ulatuvad alates toiduvalkude seedimisest kuni väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadideni nt vere hüübimise kaskaad.

rekursiooni- ja keerukusteooria

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Liina Reimann 134537KATB Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke.

Bioorgaaniline keemia

docx

3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (EC 3.4.4) on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassida peptiide ja vabu aminohappeid. Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid

Biokeemia

docx

3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine - Biokeemia labori protokoll

Tallinna Tehnikaülikool 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Biokeemia labori protokoll 2011 Töö teoreetilised alused Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides. Seejuures nad produtseerivad madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase on kõikides organismides, sest nad täidavad füsioloogilisi funktsioone, sealhulgas

Biokeemia

docx

TTÜ Biokeemia praktikum: Proteaas

peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud on endopeptidaasid. Ensüümi toimimise optimaalse keskkonna järgi eristatakse hapusid (pH ~2,5), neutraalseid (pH ~7,2) ja leelisproteaase (pH ~9,0). Aktiivtsentri ehituse järgi jaotatakse proteaasid põhiliselt seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasideks. Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ehk märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise

Biokeemia

Rohkem sarnaseid

Kommentaarid (0)

Kommentaarid sellele materjalile puuduvad. Ole esimene ja kommenteeri

Kõik kommentaarid

.DOCX Laadi alla originaalfail 6 lk