Labor FK23 protokoll laboritöö (0)

TTÜ Materjali- ja keskkonnatehnoloogia Instituut KYF0280 Füüsikaline keemia Üliõpilase nimi: Franz Mathias Ints Töö nr: FK23 Töö pealkiri: Sahharoosi Ensüümreaktsiooni Kineetiliste Parameetrite Määramine


TTÜ Materjali- ja keskkonnatehnoloogia Instituut KYF0280 Füüsikaline keemia Õpperühm: EANB31 Töö teostamise kuupäev: 21.10.2020 Töö pealkiri: Sahharoosi Ensüümreaktsiooni Kineetiliste Parameetrite Määramine


Töö eesmärk (või töö ülesanne).  sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver-Burki 
koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S).  Teooria Ensüüm reaktsiooni kineetikat kirjeldab Michaelis-Menteni vôrrand:  kus v0 – reaktsiooni algkiirus; S0 – substraadi algkontsentratsioon; Km- Michaelis-Menteni konstant; vmax – 
maksimaalne kiirus Konstandi Km sisuline tähendus: kui [S]0 = Km, siis v0 = ehk Km on substraadi  kontsentratsioon, mille juures reaktsiooni kiirus on pool maksimaalsest. Järeldus: mida väikesem on Km , seda 
madalama substraadi kontsentratsiooni juures töötab ensüüm (ferment) efektiivselt. See kirjeldab produkti 
moodustumise kiirust katalüüsi algperioodil. Väga kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel limiteerivad 
reaktsiooni kiirust vaid ensüümi hulk (ja reaktsiooni tingimused). Kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel on  ensüüm täielikult reaktsioonis hõivatud.  Sahharoosi inversioonireaktsiooni (hüdrolüüsi) produktideks on glükoos ja fruktoos:  Reaktsioon kulgeb vesilahuses (kusjuures vee kontsentratsioon on tunduvalt suurem sahharoosi 
kontsentratsioonist) esimest järku reaktsioonina. Inversioonireaktsiooni kiirus on neutraalses keskkonnas väga 
väike, seetõttu kiirendatakse reaktsiooni katalüsaatorite – kas mineraalhapete või (antud töös) 
ensüümkatalüsaatorite – abil. Reaktsiooni kiirust mõõdetakse lahust läbiva polariseeritud valguse  polarisatsioonitasandi pöördenurga ajalise muutuse kaudu. Seda võimaldab suhkru ja tema 
lagunemisproduktide optiline aktiivsus. Sahharoos pöörab polarisatsioonitasandit paremale (eripööre [αeri] = eri] = 
66,550 ), tema inversiooniproduktide segu aga vasakule, kuna glükoos pöörab paremale (eripööre [αeri] = eri] = 
52,50 ), fruktoos aga vasakule ([αeri] = eri] = - 91,90 ). Seetõttu reaktsiooni kulgemisel polarisatsioonitasandi  pöördenurk väheneb, muutub võrdseks nulliga ja seejärel negatiivseks. Reaktsiooni lõppemisele vastab 
konstantne negatiivne pöördenurga piirväärtus. Pöördenurk αeri] =  sõltub eripöördest [αeri] = eri], lahusekihi paksusest 
(toru pikkusest) l ja 2 vmax kontsentratsioonist c: αeri] =  = f([αeri] = eri], l ,c). Polarisatsioonitasandi pöördenurka 
mõõdetakse polarimeetri abil Töövahendid.  Polarimeeter KRÜSS, kolb suhkrulahuse segamiseks Töö käik. 
1)  Esmalt täidetakse polarimeetri toru (toru pikkus l=100 mm) määratletud kontsentratsiooniga  suhkrulahusega
2)  valatakse suhkrulahus polameetri torust välja 3)  Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi kolvis 25 ml-le suhkrulahusele 1 ml ensüümi (invertaas)  lahust, ning koheselt fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg,
4)  Loputatakse polarimeetri toru ja täidetakse (mullideta!) reaktsioonisegust võetud prooviga. Toru asetatakse  polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka
5)  Esimene mõõtmine võetakse lühimal ajahetkel, mis võimalik. Edasi teostatakse mõõtmisi kindla ajavahemiku  tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida aeg edasi, seda harvemini). 


Töö eesmärk (või töö ülesanne).  sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver-Burki 
koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S).  Teooria Ensüüm reaktsiooni kineetikat kirjeldab Michaelis-Menteni vôrrand:  kus v0 – reaktsiooni algkiirus; S0 – substraadi algkontsentratsioon; Km- Michaelis-Menteni konstant; vmax – 
maksimaalne kiirus Konstandi Km sisuline tähendus: kui [S]0 = Km, siis v0 = ehk Km on substraadi  kontsentratsioon, mille juures reaktsiooni kiirus on pool maksimaalsest. Järeldus: mida väikesem on Km , seda 
madalama substraadi kontsentratsiooni juures töötab ensüüm (ferment) efektiivselt. See kirjeldab produkti 
moodustumise kiirust katalüüsi algperioodil. Väga kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel limiteerivad 
reaktsiooni kiirust vaid ensüümi hulk (ja reaktsiooni tingimused). Kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel on  ensüüm täielikult reaktsioonis hõivatud.  Sahharoosi inversioonireaktsiooni (hüdrolüüsi) produktideks on glükoos ja fruktoos:  Reaktsioon kulgeb vesilahuses (kusjuures vee kontsentratsioon on tunduvalt suurem sahharoosi 
kontsentratsioonist) esimest järku reaktsioonina. Inversioonireaktsiooni kiirus on neutraalses keskkonnas väga 
väike, seetõttu kiirendatakse reaktsiooni katalüsaatorite – kas mineraalhapete või (antud töös) 
ensüümkatalüsaatorite – abil. Reaktsiooni kiirust mõõdetakse lahust läbiva polariseeritud valguse  polarisatsioonitasandi pöördenurga ajalise muutuse kaudu. Seda võimaldab suhkru ja tema 
lagunemisproduktide optiline aktiivsus. Sahharoos pöörab polarisatsioonitasandit paremale (eripööre [αeri] = eri] = 
66,550 ), tema inversiooniproduktide segu aga vasakule, kuna glükoos pöörab paremale (eripööre [αeri] = eri] = 
52,50 ), fruktoos aga vasakule ([αeri] = eri] = - 91,90 ). Seetõttu reaktsiooni kulgemisel polarisatsioonitasandi  pöördenurk väheneb, muutub võrdseks nulliga ja seejärel negatiivseks. Reaktsiooni lõppemisele vastab 
konstantne negatiivne pöördenurga piirväärtus. Pöördenurk αeri] =  sõltub eripöördest [αeri] = eri], lahusekihi paksusest 
(toru pikkusest) l ja 2 vmax kontsentratsioonist c: αeri] =  = f([αeri] = eri], l ,c). Polarisatsioonitasandi pöördenurka 
mõõdetakse polarimeetri abil Töövahendid.  Polarimeeter KRÜSS, kolb suhkrulahuse segamiseks Töö käik. 
1)  Esmalt täidetakse polarimeetri toru (toru pikkus l=100 mm) määratletud kontsentratsiooniga  suhkrulahusega
2)  valatakse suhkrulahus polameetri torust välja 3)  Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi kolvis 25 ml-le suhkrulahusele 1 ml ensüümi (invertaas)  lahust, ning koheselt fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg,
4)  Loputatakse polarimeetri toru ja täidetakse (mullideta!) reaktsioonisegust võetud prooviga. Toru asetatakse  polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka
5)  Esimene mõõtmine võetakse lühimal ajahetkel, mis võimalik. Edasi teostatakse mõõtmisi kindla ajavahemiku  tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida aeg edasi, seda harvemini). 


Töö eesmärk (või töö ülesanne).  sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver-Burki 
koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S).  Teooria Ensüüm reaktsiooni kineetikat kirjeldab Michaelis-Menteni vôrrand:  kus v0 – reaktsiooni algkiirus; S0 – substraadi algkontsentratsioon; Km- Michaelis-Menteni konstant; vmax – 
maksimaalne kiirus Konstandi Km sisuline tähendus: kui [S]0 = Km, siis v0 = ehk Km on substraadi  kontsentratsioon, mille juures reaktsiooni kiirus on pool maksimaalsest. Järeldus: mida väikesem on Km , seda 
madalama substraadi kontsentratsiooni juures töötab ensüüm (ferment) efektiivselt. See kirjeldab produkti 
moodustumise kiirust katalüüsi algperioodil. Väga kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel limiteerivad 
reaktsiooni kiirust vaid ensüümi hulk (ja reaktsiooni tingimused). Kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel on  ensüüm täielikult reaktsioonis hõivatud.  Sahharoosi inversioonireaktsiooni (hüdrolüüsi) produktideks on glükoos ja fruktoos:  Reaktsioon kulgeb vesilahuses (kusjuures vee kontsentratsioon on tunduvalt suurem sahharoosi 
kontsentratsioonist) esimest järku reaktsioonina. Inversioonireaktsiooni kiirus on neutraalses keskkonnas väga 
väike, seetõttu kiirendatakse reaktsiooni katalüsaatorite – kas mineraalhapete või (antud töös) 
ensüümkatalüsaatorite – abil. Reaktsiooni kiirust mõõdetakse lahust läbiva polariseeritud valguse  polarisatsioonitasandi pöördenurga ajalise muutuse kaudu. Seda võimaldab suhkru ja tema 
lagunemisproduktide optiline aktiivsus. Sahharoos pöörab polarisatsioonitasandit paremale (eripööre [αeri] = eri] = 
66,550 ), tema inversiooniproduktide segu aga vasakule, kuna glükoos pöörab paremale (eripööre [αeri] = eri] = 
52,50 ), fruktoos aga vasakule ([αeri] = eri] = - 91,90 ). Seetõttu reaktsiooni kulgemisel polarisatsioonitasandi  pöördenurk väheneb, muutub võrdseks nulliga ja seejärel negatiivseks. Reaktsiooni lõppemisele vastab 
konstantne negatiivne pöördenurga piirväärtus. Pöördenurk αeri] =  sõltub eripöördest [αeri] = eri], lahusekihi paksusest 
(toru pikkusest) l ja 2 vmax kontsentratsioonist c: αeri] =  = f([αeri] = eri], l ,c). Polarisatsioonitasandi pöördenurka 
mõõdetakse polarimeetri abil Töövahendid.  Polarimeeter KRÜSS, kolb suhkrulahuse segamiseks Töö käik. 
1)  Esmalt täidetakse polarimeetri toru (toru pikkus l=100 mm) määratletud kontsentratsiooniga  suhkrulahusega
2)  valatakse suhkrulahus polameetri torust välja 3)  Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi kolvis 25 ml-le suhkrulahusele 1 ml ensüümi (invertaas)  lahust, ning koheselt fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg,
4)  Loputatakse polarimeetri toru ja täidetakse (mullideta!) reaktsioonisegust võetud prooviga. Toru asetatakse  polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka
5)  Esimene mõõtmine võetakse lühimal ajahetkel, mis võimalik. Edasi teostatakse mõõtmisi kindla ajavahemiku  tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida aeg edasi, seda harvemini). 


Töö eesmärk (või töö ülesanne).  sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver-Burki 
koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S).  Teooria Ensüüm reaktsiooni kineetikat kirjeldab Michaelis-Menteni vôrrand:  kus v0 – reaktsiooni algkiirus; S0 – substraadi algkontsentratsioon; Km- Michaelis-Menteni konstant; vmax – 
maksimaalne kiirus Konstandi Km sisuline tähendus: kui [S]0 = Km, siis v0 = ehk Km on substraadi  kontsentratsioon, mille juures reaktsiooni kiirus on pool maksimaalsest. Järeldus: mida väikesem on Km , seda 
madalama substraadi kontsentratsiooni juures töötab ensüüm (ferment) efektiivselt. See kirjeldab produkti 
moodustumise kiirust katalüüsi algperioodil. Väga kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel limiteerivad 
reaktsiooni kiirust vaid ensüümi hulk (ja reaktsiooni tingimused). Kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel on  ensüüm täielikult reaktsioonis hõivatud.  Sahharoosi inversioonireaktsiooni (hüdrolüüsi) produktideks on glükoos ja fruktoos:  Reaktsioon kulgeb vesilahuses (kusjuures vee kontsentratsioon on tunduvalt suurem sahharoosi 
kontsentratsioonist) esimest järku reaktsioonina. Inversioonireaktsiooni kiirus on neutraalses keskkonnas väga 
väike, seetõttu kiirendatakse reaktsiooni katalüsaatorite – kas mineraalhapete või (antud töös) 
ensüümkatalüsaatorite – abil. Reaktsiooni kiirust mõõdetakse lahust läbiva polariseeritud valguse  polarisatsioonitasandi pöördenurga ajalise muutuse kaudu. Seda võimaldab suhkru ja tema 
lagunemisproduktide optiline aktiivsus. Sahharoos pöörab polarisatsioonitasandit paremale (eripööre [αeri] = eri] = 
66,550 ), tema inversiooniproduktide segu aga vasakule, kuna glükoos pöörab paremale (eripööre [αeri] = eri] = 
52,50 ), fruktoos aga vasakule ([αeri] = eri] = - 91,90 ). Seetõttu reaktsiooni kulgemisel polarisatsioonitasandi  pöördenurk väheneb, muutub võrdseks nulliga ja seejärel negatiivseks. Reaktsiooni lõppemisele vastab 
konstantne negatiivne pöördenurga piirväärtus. Pöördenurk αeri] =  sõltub eripöördest [αeri] = eri], lahusekihi paksusest 
(toru pikkusest) l ja 2 vmax kontsentratsioonist c: αeri] =  = f([αeri] = eri], l ,c). Polarisatsioonitasandi pöördenurka 
mõõdetakse polarimeetri abil Töövahendid.  Polarimeeter KRÜSS, kolb suhkrulahuse segamiseks Töö käik. 
1)  Esmalt täidetakse polarimeetri toru (toru pikkus l=100 mm) määratletud kontsentratsiooniga  suhkrulahusega
2)  valatakse suhkrulahus polameetri torust välja 3)  Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi kolvis 25 ml-le suhkrulahusele 1 ml ensüümi (invertaas)  lahust, ning koheselt fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg,
4)  Loputatakse polarimeetri toru ja täidetakse (mullideta!) reaktsioonisegust võetud prooviga. Toru asetatakse  polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka
5)  Esimene mõõtmine võetakse lühimal ajahetkel, mis võimalik. Edasi teostatakse mõõtmisi kindla ajavahemiku  tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida aeg edasi, seda harvemini). 


Jrk nr Kellaaeg 1 10:43 2 1.45 2 10:45 4 1.33 3 10:47 6 1.22 4 10:49 8 1.09 5 10:51 10 0.98 6 10:56 15 0.71 7 11:01 20 0.48 8 11:06 25 0.29 9 11:11 30 0.14 10 11:16 35 -0.04 11 11:21 40 -0.07 12 11:26 45 -0.14 13 11:31 50 -0.2 14 11:41 60 -0.28 15 11:51 70 -0.34 16 12:01 80 -0.37 17 12:11 90 -0.4 18 12:21 100 -0.41 19 12:41 120 -0.43 20 1447 -0.46 2) reakts algkiirus
Ajahetk: t = 10 min Pöördenurk: 
Konsenstratsioon ajahetkel: St = 0.0527 Algkiirus:  Aeg reaktsiooni  algusest, min Polarimeetri  näit, αeri] =  Järgmine päev 
10:34 [𝑆_0 ]=(2,4∗1000)/(100∗342)=0,07 𝑚𝑜𝑙/𝑙  𝛼_10=0,98 𝑣_0=(𝑆_0−𝑆_𝑡)/𝑡=(0,07−0,0527)/(10∗60)  = 28,8*10^-6 mol/l*s 




Katse temperatuur: 23.1C Suhkrulahuse konsentratsioon: 2.4% Katalüsaator: Invertaas Suhkrulahuse lähtepöördenurk αeri] = 0: 1.62 Reaktsiooni alguse kellaaeg: 10:41 1) Kalibreerimine: 1.45 0.07 αeri] = = -0.46 S= 0 0.07 14.29 28.8*10^6 0.82 1.22 7.38E-05 αeri] = 0= S0= 3) Km ja Vmax leidmine S0 1/S0 v0 [𝑆_0 ]=(2,4∗1000)/(100∗342)=0,07 𝑚𝑜𝑙/𝑙  -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 f(x) = 0.036649214659686 x + 0.016858638743456 Kalibreerimisgraafik αeri] =   S ,  m o l/ l 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 f(x) = 1620.199952 x + 11574.2864 Kiiruse pöördväärtuse sõltuvus kontsentratsiooni pöördväärtusest 1/S0, l/mol 1 /v 0 ,  l* s/ m o l


1.62 0 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 f(x) = 1620.199952 x + 11574.2864 Kiiruse pöördväärtuse sõltuvus kontsentratsiooni pöördväärtusest 1/S0, l/mol 1 /v 0 ,  l* s/ m o l 1/𝑣_𝑚𝑎𝑥 =11574⇒ 𝑣_𝑚𝑎𝑥=0,0000864=8,64∗ 〖 10 〗 ^(−5)  𝑚𝑜𝑙/(𝑙∗𝑠) 𝐾_𝑚/𝑣_𝑚𝑎𝑥 =1620,2⇒ 𝐾_𝑚=0,139 M


4) Michaelis-Menteni graafik 0.07 0.139 34720 13550.14 1/v0 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 f(x) = 0.036649214659686 x + 0.016858638743456 Kalibreerimisgraafik αeri] =   S ,  m o l/ l 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 f(x) = 1620.199952 x + 11574.2864 Kiiruse pöördväärtuse sõltuvus kontsentratsiooni pöördväärtusest 1/S0, l/mol 1 /v 0 ,  l* s/ m o l 𝑣_0=(8,64∗ 〖 10 〗 ^(−5)∗0,07)/(0,139+0,07)=0,000028=28,8∗ 〖 10 〗 ^(−6)  𝑚𝑜𝑙/(𝑙∗𝑠) 𝑆_0 𝑆_0=𝐾_𝑚 𝑣_0  = 28,8*10^-6   
  𝑣_0  = 𝑣_𝑚𝑎𝑥/2= 4,32*10^-5 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 -9.99999999999995E-06 5.42101086242752E-20 1.00000000000001E-05 2E-05 3E-05 4E-05 5E-05 6E-05 7E-05 8E-05 9E-05 Michaelis-Menteni graafik S0 v 0 𝑣_𝑚𝑎𝑥 𝐾_𝑚 𝑣_0  " = " 𝑣_𝑚𝑎𝑥/2


0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 f(x) = 1620.199952 x + 11574.2864 Kiiruse pöördväärtuse sõltuvus kontsentratsiooni pöördväärtusest 1/S0, l/mol 1 /v 0 ,  l* s/ m o l


9.6E-06 1.728E-05 2.88E-05
4.32E-05
5.76E-05
6.48E-05 6.912E-05 𝑣_0=(8,64∗ 〖 10 〗 ^(−5)∗0,07)/(0,139+0,07)=0,000028=28,8∗ 〖 10 〗 ^(−6)  𝑚𝑜𝑙/(𝑙∗𝑠) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 -9.99999999999995E-06 5.42101086242752E-20 1.00000000000001E-05 2E-05 3E-05 4E-05 5E-05 6E-05 7E-05 8E-05 9E-05 Michaelis-Menteni graafik S0 v 0 𝑣_𝑚𝑎𝑥 𝐾_𝑚 𝑣_0  " = " 𝑣_𝑚𝑎𝑥/2


0.017375 0.03475 0.0695 0.139
0.278
0.417
0.556


Järeldus 2.4% sahharoosilahuse reaktsiooni algkiiruseks sain 28,8*10^-6 mol/l*s  ning v,max tuli 
8,64∗ 〖 10 〗 ^(−5)  𝑚𝑜𝑙/(𝑙∗𝑠)  ja    Km = 0,139 M Kirjandusliku allika põhjal: Km = 150 mM => 0.150 M                                                 V,max = 1 mM/min = 1.66*10^-5 mol/s Kasutatud allikad: -õppejõu poolt praktikumi juhend moodles


Järeldus 2.4% sahharoosilahuse reaktsiooni algkiiruseks sain 28,8*10^-6 mol/l*s  ning v,max tuli 
8,64∗ 〖 10 〗 ^(−5)  𝑚𝑜𝑙/(𝑙∗𝑠)  ja    Km = 0,139 M Kirjandusliku allika põhjal: Km = 150 mM => 0.150 M                                                 V,max = 1 mM/min = 1.66*10^-5 mol/s Kasutatud allikad: -õppejõu poolt praktikumi juhend moodles


Siia tuleb lisada (skaneeritult või fotona) õppejõu poolt antud tööülesanne ja õppejõu  poolt allkirjastatud originaalkatseandmete leht.


Siia tuleb lisada (skaneeritult või fotona) õppejõu poolt antud tööülesanne ja õppejõu  poolt allkirjastatud originaalkatseandmete leht.

Document Outline

• Tiitelleht
• Teooria ja töö käik
• Arvutused, tabelid ja graafikud
• Järeldus
• Originaalkateseandmed