Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (0)

Biokeeemia laboratoorne töö No 7
Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine.
Õpperühm: YAGB21
Töö teostaja : Alexander Kirichuk 123695
Õppejõud: Tiina Randla
Õppejõu märkused: Proteaasi aktiivsus: taas - kus on järeldused ja kokkuvõte? Mida uurisite, millise tulemuse saite? Kas see on ootuspärane? Antud juhul ei saa väga võrrelda teooria ja praktika kooskõla, aga oma töökultuurile saab hinnangu anda ikka. 
Konkreetsemalt otseselt töö sisusse puutuvalt: antud töös ei pea arvutama n aktiivsust. Tuleb võtta sirgelt mingile ajavahemikule vastav kontsentratsiooni muut ja need valemisse asendada . Tegelikult annab vajaliku delta c/delta t suhte sirge võrrandi ees olev kordaja. 
Kus on öeldud, millist preparaati (nimetus!) uurisite? 
Teoreetilised alused.

• Proteaasid – ensüümid mis kataküüsivad peptiidsideme hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, mille tulemuseks tekkivad madalama molekulmassiga peptiidid ja vabad aminohapped .
  

Need leiduvad kõikides organismides ja osalevad paljudes organismis toimuvaid reaktsioonuides.(näiteks valkude seedimises)

• Proteaasidel on erinev spetsiifilisus. On olemas nii väga spetsiifilised , kui ka need, mis toimivad kõikidele peptiidsidemele.
  
• Eristatakse ekzo- ja endopeptidaase, mis sõltub sellest, kas proteaas toimib peptiidahela kesketele või otsmistele peptiidsidemetele.
  
• Optimaalse keskonna pH järgi eristatakse hapusid, neutraalsed ja leelisproteaase.
  
• Oluline proteaasi klafitsiooni aspektiks on aktiivtsentri ehitus, millist sõltub toimemehanism.(näiteks tiool -, seriin-, aspartaat - ja metalloproteinaasid).
  
• 1 µkat - ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks, mis peegeldab 1 µmooli peptiidsideme hüdrolüüsi 1 sekundi jooksul 30◦C juures. (kuid seda on raske mõelda siis proteaaside aktiivsus avaldatakse vabanevate produktide hulga kaudu)
  

• Neutraale ja alulise proteaaside aktiivasusi määramise jaoks kasutatakse põhiliselt kaseiini .
  Kaseiin – valk(fosfoproteiin), mis leidub piimas. Kaseiini molekulid on hüdrofoobsed ja esinevad piimas mitsellina. (Na-kaseinaat aga lahustub vees).
  Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseinni hüdrolüüsi algstaadiumit, kui polüpeptiidahelas on katkenud ainult üksikud peptiidsidemed.
  

• Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhin kaseiini hüdrolüüsil proteaasi toimel ja järgneval trikloorädikhappega mittesadeneva hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilise meetodi kasutades.
  

• Aromaattuuma omavad aminohapped ( Tyr, Phe, Trp) omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkusel 270-280 nm, siis väljendatakse kasieiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentatsioonina mg/ml ja kasutades kaliibrimisgraafikut leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides.
  

Töö käik.

• Valmistame proteaasi preparaadist lahuse valmistamine.( Alkalaas )
  Peab olema sobiv pH (meie juhul aluliseline). Lahuse ensüümi kontsentratsioon on 1,6 mg/ml . Paneme gradueeritud katseklaasi 8 mg ensüümipreparaadi ja lisame puhverlahust 5 milliliitrini.
  
• Võtame suur 50 ml katseklaas ja pipeteerime 25 ml 2%-list kaseiini lahust. Klaas asutatkse vesitermostaati 30◦C juurde 10 minutiks soojenema.
  
• Sel ajal võtame 4 katseklaasi ja pipeteerime igaühte 3 ml 5%-list TKÄ lahust.
  
• Kui kaseiini lahus on soojenud, alustame ensüümi reaktsioon . Selleks lisame kaseiinile 1ml enne valmistatud proteaasilahust. Loksutame kaseiini katseklaasi, võtame sellest 3 ml proovi ja lisame esimesse TKÄ- katseklaasi(see on meie nullproov), ja paneme kaseiini katseklaasi tagasi termostaati.
  
• 5, 10, 15-l minutil võtame veel 3 ml proovi ja lisame seda 2, 3, ja 4-le trikloorädikhappe sisaldavasse katseklaasidele.
  
• Selle tulemusena tekkib katseklaasides valge sade(pikad polüpeptiidid, mis reageerisd TKÄga, sade meile ei ole vaja).
  
• Filtreerime 4 katseklaasi sisaldava lahusi.
  
• Spektrofotomeetriga määrame 4 proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel 280nm.
  
• Kalibrimisgraafikut kasutades leitakse proovide optiliste tiheduste järgi nendes sisalduva türosiini kontsentratsioon.
  
• Saadud andmete alusel koostame graafik , mis väljendub türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust. (Ctyr=f(t)).
  
• Leiame ensüümipreparaadi proteolüütilist aktiivsust(A), kasutade antud valemi:
  

A= ∆Ctyr ● 103 ● V1 ●V2● 2/∆t ● 181 ● V3 ● g
Kus:

• ∆Ctyr -türosiini kontsentratsiooni muudus valiud ajavahemikus (mg/ml)
  
• ∆t -hüdrolüüsi kestus (s)
  
• V1 -reaktsoonisegu üldmaht (ml)
  
• V2-valmistatud ensümilahuse üldmaht (ml)
  
• 2 – TKÄlahusest tingitud proovi lahjendus
  
• V3- ensüümi maht hüdrolüsisegus (ml)
  
• g - proteaasi preparaadi kaalutis (g)
  
• 181 – türosiini molekullmass.
  

Töö tulemused.
Proovi number (0 minutil)
Optiline tihedus lainepikusel 280 nm (ABS)
Türosiini kontsentratsioon. (mg/ml)
Proov 0
0,441
0,070
Proov 1 (5 minutil võetud)
0,545
0,086
Proov 2 (10 minutil)
0,660
0,105
Proov 3 (15 minutil)
0,840
0,133
Saanud andmete järgi koostame graafik.

• Leiame ensüümipreparaadi proteolüütilist aktiivsust(A), kasutade antud valemi:
  

A= ∆Ctyr ● 103 ● V1 ●V2● 2/∆t ● 181 ● V3 ● g
A1= ((0,133-0,070)*103 *26 *5 *2/(15*60) *181 * 1 *0,0080 = 26,35 µkat/g
A2=(0,105-0,070)* 103 *26 *5 *2/(10*60) *181 * 1 *0,0080 =22 µkat/g
A3=(0,086-0,070)* 103 *26 *5 *2/(5*60) *181 * 1 *0,0080 =20 µkat/g
A = (A3+A2+A1)/3 =22,8 µkat/g
Võtame aja vahemiku 4-10 min.
A= (0.105-0,08)*103*26*5*2/(6*60) *181*1*0,0080= 26,1 µkat/g
Kokkuvõte ja järeldused.
Me olime uuritanud proteolüütilise ensüümi aktiivsust. (Alkalaas) Substraadina olime kasutanud kaseiini. Tulemusena sai aktiivsuse väärtust 26 ukat, mis on palju väiksem, kui teoreetiline, kuid tean et ensüümid kunagi ei jõua nende teoreetiliselt maksimalsene kiiruseni.