Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Materjaliteaduse instituut
Füüsikalise keemia õppetool
Üliõpilane:
Teostatud: 22.02.2012.
Õpperühm:
Kontrollitud:
Töö nr. 23FK
Arvestatud:
Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine
FK23a Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine
Töö eesmärk ja üldmõisted:
Eesmärgiks on ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver-
Burki koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S). Samuti on võimalik määrata
ensüümi aktiivsust (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi
ensüümi toimel 1 sekundi jooksul ehk teiste sõnadega reaktsiooni kiirus ühikulise hulga
ensüümi toimel).
Üldmõisted: Erinevalt esimest järku kineetilisest võrrandist kirjeldub reaktsiooni kiirus
sõltuvana substraadi kontsentratsioonist võrdhaarse hüperboolina ( graafik käitub vastavalt
Michaelise- Menteni võrrandile). Väga kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel limiteerivad
reaktsiooni kiirust vaid ensüümi hulk (ja reaktsiooni tingimused). Kõrgetel substraadi
kontsentratsioonidel on ensüüm täielikult reaktsioonis hõivatud. Kui oleme määranud Km ja
Vmax , siis oleme ka määranud ensüümreaktsiooni kiiruse v igal ajahetkel vastavalt
Michaelise-Menteni võrrandile, teades eelnevalt katseks kasutatud substraadi ja ensüümi
kontsentratsiooni. Km on ensüümi ja substraadi vahelise reaktsioonivõimelisuse mõõduks.
Mida väikesem on Km , seda suurem on reaktsioonivõimelisus, seda vähem dissotsieeruvam ja
tugevam on vahekompleks ES. Michaelis-Menteni võrrandi järgi, kui S = Km , siis v=
Seega on vmax teadmine tähtis ensüümi töövõime mõõtmiseks. Selle mõistmiseks
on vajalik tutvuda (veel kord) Michaelis-Menteni võrrandi tuletuskäiguga.
Laboratoorse töö teoreetilised alused: Reaktsiooni produktideks on glükoos ja fruktoos :
Reaktsioon kulgeb vesilahuses ( kusjuures vee kontsentratsioon on tunduvalt suurem
sahharoosi kontsentratsioonist) esimest järku reaktsioonina. Inversioonireaktsiooni kiirus on
neutraalses keskkonnas väga väike, seetõttu kiirendatakse reakstsiooni katalüsaatorite – kas
mineraalhapete või (antud töös) ensüümkatalüsaatorite – abil. Reaktsiooni kiirust mõõdetakse
lahust läbiva polariseeritud valguse polarisatsioonitasandi pöördenurga ajalise muutuse kaudu.
Seda võimaldab suhkru ja tema lagunemisproduktide optiline aktiivsus. Sahharoos pöörab
polarisatsioonitasandit paremale (eripööre [αeri] = 66,550), tema inversiooniproduktide segu
aga vasakule, kuna glükoos pöörab paremale (eripööre [αeri] = 52,50), fruktoos aga vasakule
([αeri] = -91,90).
Eripöörde mõiste:
Optiliselt aktiivset ainet läbinud valguse polarisatsioonitasandi pöördenurk α sõltub ainest,
ainekihi paksusest l , valguse lainepikkusest λ , temperatuurist t ja lahuste korral ka
kontsentratsioonist c . Osutub, et antud temperatuuri ja lainepikkuse korral on valguse
polarisatsioonitasandi pöördenurk lahustes võrdeline lahusekihi paksusega ja optiliselt aktiivse aine
kontsentratsiooniga lahuses: α
Suurust
nimetatakse optiliselt aktiivse aine eripööranguks. Ta näitab, kui suure nurga võrra
pöördub polarisatsioonitasand, kui valgus lainepikkusega λ läbib ühikulise kontsentratsiooniga ja
ühikulise paksusega lahuse kihi, mille temperatuur on T .
Käsiraamatutes antakse eripöörang tavaliselt naatriumi D-joone lainepikkusel (λ = 589,3 nm )
ning temperatuuril T = 20 oC . Vastavat eripöörangut tähistatakse . Seega:
Valemist on näha, et lahuse eripöörangu määramiseks on vaja teada lahuse kontsentratsiooni,
lahusekihi paksust l ja polarisatsioonitasandi pöördenurka.
Seetõttu reaktsiooni kulgemisel polarisatsioonitasandi pöördenurk väheneb, muutub võrdseks
nulliga ja seejärel negatiivseks. Reaktsiooni lõppemisele vastab konstantne negatiivne
piirväärtus. Pöördenurk αΣ sõltub eripöördest [αeri], lahusekihi paksusest (toru pikkusest) l ja
kontsentratsioonist c: αΣ= f([αeri], l ,c). Meie katses l = 0,2m. Polarisatsioonitasandi
pöördenurka mõõdetakse polarimeetri abil.
Töö ettevalmistamine:
Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus
valmistatakse 0,1-0,5% (või kuni 2%) invertaasi lahusena atsetaatpuhvris (0,1M), mille pH ≈
4,8. Sahharoosi algne 0,1M lahus valmistatakse puhvris, mille pH ≈4,8. Sellest valmistatakse
lahjendusega omakorda madalama kontsentratsiooniga lahus (näiteks 0.05M, 0.025M või
0.0125M sahharoosi lahus). Lahjendamine toimub samuti puhvriga. Vajadusel tehakse
viimasest lahjendusest veel kord üks lahjendus veelgi väikesema substraadi kontsentratsiooni
(näiteks 0.00625M) saamiseks.
Töö teostamine :
Esmalt täidetakse polameetri toru lähtesuhkrulahusega selleks et määrata lähtepöördenurk
(alghetke t = 0 väärtus) . Seejärel valatakse lähtelahus polameetri torust välja ja puhastatakse
see. Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi katseklaasis 25 ml-le määratletud
kontsentratsiooniga (näiteks 0.1M kuni 0,00625M)) suhkru lahusele 1 ml ensüümi ( invertaas ),
ning koheselt fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg, käivitades stopperi. Loputatakse
polarimeetri toru ja täidetakse (mullideta) reaktsioonisegust võetud prooviga. Toru asetatakse
polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka, seades analüsaatori
poolvarjuasendisse (või automaatselt polarimeetriga POLAMAT). Esimese mõõdetud nurga
võetakse polarisatsioonitasandi pöördenurgaks lühimal ajahetkel, mis võimalik.
Edasi teostatakse mõõtmiseid kindla ajavahemiku tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min,
järel, siis 10 min järel, ning mida aeg edasi, seda harvemini). Viimase lugemi võtmisel
eeldatakse, et reaktsioon on toimunud.
Katse 0,2% sahharoosilahusega
Aeg,min
2,10
0,7
4,00
0,62
6,00
0,51
8,00
0,43
10,00
0,35
15,00
0,19
20,00
0,1
25,00
0,04
30,00
-0,02
35,00
-0,05
40,00
-0,09
45,00
-0,11
50,00
-0,11
55,00
-0,16
60,00
-0,16
65,00
-0,17
70,00
-0,18
75,00
-0,18
Kalibreerimine : Algne sahharoosilahus oli 0,6%. Kuna M(C12H22O11) = 342 ja
katsetulemuste tabelist leiame, et 8 minuti pärast näitab Polamat α = 0.43, siis on vaja
teada sellele pöördenurgale vastavat substraadi (järelejäänud) kontsentratsiooni. Selle
määramiseks konstrueerime kalibreerimissirge.
Pöördenurk kontsentratsioon
αo
0,85
So
0, 0175
α∞
-0,18
S∞
0
Ksenia Kuksina (0,6%)
[S]0 = =0,0175 mol/ls
6 minuti pärast oli pöördenurk α = 0,43 ja sellele vastav S = 0.0104mol/l.
Algkiirus v0 = (0.0175-0. 0104 )/8x60 = 1,48*mol/ls
Kokkuvõttes: kui S0 = 0.0175, siis v0 = 1,48*mol/ls
Km ja vmax leidmine kasutades 0,6% ja 14% sahharoosi lahuseid
S0
S0-1
V0
V0-1
0.0175
57,1429
1,48∙10-5
67567,6
0.41
2.43902
4.37∙10-5
22883.3
vmax-1=20891. Siit vmax=4.79∙10-5 mool/ls.
Km∙ vmax-1=816,84,sellest Km=0,039M.