Biokeemia praktikum, Laboratoorne töö nr 2 (3)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
KEEMIAINSTITUUT
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL3312 Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö
1. Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega
1.1 Valkude reaktsioonid
1.2 Süsivesikute reaktsioonid
Tallinn 2010
1. AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA
Kvalitatiivsed reaktsioonid võimaldavad kindlaks teha mingi keemilise elemendi, funktsionaalse rühma, ühendi või teatud omadustega ainete grupi olemasolu või puudumist uuritavas keskkonnas. Enamasti hinnangut antakse värvuse tekke, sademe moodustumise, gaasi eraldumise või muu silmaga nähtava muutuse alusel. Kvalitatiivsed reaktsioonid ei nõua aine täpset doseerimist, enamasti võib piirduda silmamõõduga.
1.1 VALKUDE RAKTSIOONID
TÖÖ TEOREETILISED ALUSED
Valgud on polüpeptiidid, mis koosnevad omavahel peptiidsidemega seotud aminohapetest. Valkudes sisalduvaid aminohappeid on 20 ning nad erinevad üksteisest radikaaldie struktuuri poolest. Valkudele nagu ka teistele biopolümeeridele on iseloomulik ruumiline struktuur. Valkude primaar struktuur iseloomustab aminohapete valikulist järjekorda, sekundaar struktuur polüpeptiidahela üksikute lõikude korda ja tertsiaar struktuur kogu valgumolekuli ruumilisust. Kui molekul koosneb enam kui ühest polupeptiidahelast moodustuvad oligomeersed valgud, mis omavad ka kvaternaarset struktuuri. Ruumilised struktuurid on fikseeritud nõrkade keemiliste sidemete ja vastasmõjudega. Kui valgu ruumilises struktuuris grupeeruvad ümber ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgad sidemed, aga säilivad aminohappeid ühendavad peptiidsidemed, siis sellist lagunemist nimetatakse denaturatsiooniks. Taastumine on reanturatsioon.
Valkude kindlakstegemiseks lahustes või bioloogilistes vedelikes ja ka nende aminohappelise koostise iseloomustamiseks kasutatakse värvusereaktsioone, denaturatsiooni protsessi uurimiseks, valkude eraldamiseks madalama molekulmassiga peptiididest ning erinevate valgusfraktsioonide lahustamiseks kasutatakse mitmeid sadestamismeetodeid. Kvalitatiivseid reaktsioone on kahte tüüpi: Universaalsed ehk üldreaktsioonid, mis on omased kõikidele valkudele ja spetsiifilised ehk erireaktsioonid , mis on iseloomulikud ainult teatud aminohapetele valgu molekulis või vastavas lahuses.
Biureedireaktsioon
Biureedireaktsiooni annavad kõik ained, mis sisaldavad vähemalt kahte peptiidsidet. Leeliselises kekskonnas annab valk vask(II)ioonidega sinakasvioletse värvuse, peptiidid aga roosa värvusega biureet-kompleksi, mis moodustub vase ioonide seostumisel peptiidsidemete koostises oleva hapniku aatomitega. Värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses.
Töö käik: Katseklaasi valati ~1 ml munavalgu lahust ja lisati 1 ml 10%-list NaOH , mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust ja loksutati. Värvus katseklaasis muutus lillakaks.
Järeldus: Lahus andis lillaka värvuse, kuna leeliselises keskkonnas, mida põhjustas NaOH lisamine lahusele, seostuvad lisatud CuSO4-st vask ioonid peptiidsideme koostises olevate hapniku aatomitega, andes lillaka biureet-kompleksi .
Mulderi reaktsioon
Reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete olemasolu. Konts. HNO3 lisamisel sadestub valk ja soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine.
Töö käik: Katseklaasi valati ~ 1 ml munavalgu lahust ja lisati 4 tilka kontsentreeritud HNO3,tekkis valge sade, saadud lahust soojendati. Lahus muutus kollakaks Pärast jahutamist lisati NH4OH kuni ammoniaagi lõhna ilmumiseni. Lahus muutus seejärel tumedamaks kollaseks, võiks öelda oranžiks.
Järeldus: Soojendamisel toimus aromaatsete tuumade nitreerumine ja saadud nitrofenooli tüüpi ühend on kollaka värvusega, sellepärast muutus lahus kollakaks. NH4OH lisamisel muutus lahus oranžiks kuna nitrofenool käitub leeliselises keskkonnas kui hape , omandades oranži värvuse.
Milloni reaktsioon
Kasutatakse elavhõbe(II) nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga ehk Milloni reaktiivi. Milloni reaktiiviga reageerivad aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped
Töö käik: Ühte katseklaasi valati 1ml munavalgu lahust ja teise 1ml želatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisati 5 tilka Milloni reaktiivi. Munavalgu lahuses tekkis valge sade. Mõlemaid katseklaasi kuumutati. Želatiini lahus jäi muutumatuna, aga munavalgu lahus värvus punaseks.
Järeldus: želatiin ei sisalda aromaatset tuuma omavaid aminohappeid ja sellepärast jäi lahus muutumatuks. Kuna munavalgu lahus sisaldab aromaatsest tuuma sisaldavat aminohapet, toimusid ka vastavad muutused.
Sulfhüdrüülreaktsioon
Sulfhüdrüülrühmad valkudes ja aminohapetesalluvad hõlpsasti leeliselisele hüdrolüüsile ja annavad sulfiidioonne. Pb2+ juuresolekul tekib mustjas ülipeen pliisulfiid sade.
Töö käik: 1 ml Pb( CH3COO )2 0,5%-lisele lahusele lisati mõni tilk, tilgakaupa 20%-list NaOH kuni tekkiva sademe lahustumiseni. Lisati 0,5 ml munavalgu lahust. Reaktsioonisegu keedeti mõne minuti vältel pruunikasmusta sademe tekkimiseni.
Järeldus: Tekkis must sade, kuna sulfiidioonid, mis tekkisid leeliselise hüdrolüüsi tõttu, reageerisid Pb2+ ioonidega ja tekkis pliisulfiid sade, mis on musta värvi.
Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroäädikhappe on laialdaselt levinud valke denatureeriv ja sadestav reagent, kuid ei sadesta valgu hüdrolüüsi produkte, mille molekulmass on alla 10000.
Töö käik: 1 ml munavalgu lahusele lisati mõni tilk trikloroäädikhapet. Tekkis valge sade.
Järeldus: Valge sade tekkis valgu denaturatsioonist. Toimus valgu eraldamine madalmolekulaarsetest lämmastikühenditest.
Valkude sadestamine sooladega
Neutraalsete soolade suured sisaldused valgu lahuses põhjustavad valkude denaturatsiooni ja lahusest väljasadenemist, mida mõjutavad valgu mitmesugused tegurid( nt hüdrofiilsus, laeng jne.).
Töö käik: 1 ml munavalgu lahusele lisati võrde hulk küllastunud (NH4) 2SO4 lahust ja jäeti umbes 5 minutiks seisma. Globuliinide sade, mis tekkis eraldati filtrimisel . Filtraadile lisati küllastumiseni kristalset (NH4)2SO4 kuni kristallid enam ei lahustu, moodustub albumiinide sade.
Järeldus: Kuna valkude sadestamist sooladega mõjutavad erinevad tegurid sadestusid globuliinid poolküllastunud lahuses, albumiinid sama soola küllastunud lahuses.
Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Kõik valgud denatureeruvad kõrgel temperatuuril ja vastav temperatuur oleneb valgu loomusest ja keskkonna koostisest. Tavaliselt kaasneb valgu väljasadestumine.
Töö käik: kahte katseklaasi valati 2 ml munavalgu lahust. Ühte lisati 1ml
kontsentreeritud äädikhapet. Mõlemaid lahuseid kuumutati keetmiseni.
Munavalgu lahus muutus kuumutamisel häguseks, munavalgu lahuses koos
äädikhappega muutusi ei toimunud.
Järeldus: Munavalgu lahud denatureerus katseklaasis ja sellele järgnes ka välja
sadestamine. PH muutusest teises katseklaasis jäi denatureerunud valk
lahusesse.
Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega
Veega segunevad solvendid ( etanool , atsetoon jt.) põhjustavad valkude
Dehüdratiseerimist ja sadestavad neid lahusest välja. Sadesti sisalduse
Vähendamisel lahustub tekkinud sade uuesti.
Töö käik: Katseklaasi valati 2 ml munavalgu lahust. Ettevaatlikult, tilgakauoa ja segu pidevalt loksutades lisati orgaanilist solventi kuni sademe tekkimiseni. Seejärel segu lahjendati veega. Sade oleks pidanud uuesti lahustuma, aga seda ei juhtunud.
Järeldus: Põhjus, miks sade ei lahustunud uuesti, võis olla orgaanilise solvendi kiires lisamises ja võis toimuda ka pöördumatu denatureerimine.
1.2 SÜSIVESIKUTE REAKTSIOONID
TÖÖ TEOREETILISED ALUSED
Süsivesikud on ulatuslik ühendite rühm. Organismides on süsivesikud energiaallikaks ja energeetiliseks varuaineks, taimedes selle kõrval ehitusmaterjalideks.
Struktuuri alusel jaotatakse süsivesikud mono -, oligo- japolüsahhariidikes. Monosahhariidid on lihtsuhkrud, millede molekuli üldvanem võib olla sama, aga erinevused on stereostruktuuris ja seetõttu võivad ka omadused erineda. Molekuli ehituselt võivad nad olla väga erinevad ( lineaarsed , polühürdoksüaldehüüdid, tsüklilised jne.). Oligosahhariidi molekulid koosnevad monosahhariidi jääkidest. Polüsahhariidides on suur arv monosahhariide, mis on ühinenud pikkadeks ahelateks. Suhkrud jaotatakse ka vastavalt vaba aldehüüdrühma esinemisele redutseerivateks ehk taandavateks ja mitteredutseerivateks ehk mittetaandavateks.
Paljud süsivesikute kvalitatiivseks määramiseks kasutatavad reaktsioonid põhinevad nende redutseerimisvõimele. Suhkrud oksüdeeruvad seejuures sõltuvalt tingimustest erinevateks produktideks. Leeliselises keskkonnas oksüdatsiooni tagajärjel suhkru ahel üldreeglina laguneb ja tekib oksüdatsiooniproduktide segu, neutraalses või happelises keskkonnas toimub suhkrute oksüdatsioon ilma molekuli lagunemiseta ja tekkivad mitmesugused happed . Teine osa meetoditest põhineb heterotsükliliste aldehüüdide moodustumisel süsivesikute kuumutamisel.
Molisch`i test
Süsivesikute olemasolu korral lahuses tekib nende segus naftalooniga kontsentreeritud väävelhappe lisamisel happe ja uuritava lahuse piirpinnale purpurne vahekiht .
Töö käik: kahte katseklaasi lisati 2 ml süsivesiku lahust, sahharoos ja glükoos. Ühte katseklaasi lisati 2 ml munavalgu lahust. Igasse katseklaasi lisati 2 ml Molischi reaktiivi ja segati hoolikalt. Seejärel lisati ettevatlikult hoides katseklaasi kaldu tilk haaval 1 ml kontsentreeritud väävelhappe lahust nii, et see voolas mööda katseklaasi seina alla. Sahharoosi puhul tekkis lillakas vahekiht ja glükoosi puhul punakas. Valgu puhul ei tekkinud vahekihti.
Järeldus: tekkisid vahekihid kuna lahuses oli süsivesikud. Valgu puhul ei tekkinud kuna antud lahuses puudusid süsivesikud.
Osasoonide saamine
Osasoonideks nimetatakse taandava suhkru ja kahe molekuli fenüülhüdrasiini liitumise produkti . Osasoonid kristalluvad lahustest hõlpsasti, omades kuju ja sulamistemperatuuri, mis on lähtesuhkrule omased.
Töö käik: Kahte katseklaasi valati 2 ml suhkru lahust, laktoosi ja maltoosi. Mõlemasse lisati 0,1g fenüülhüdratsiini ja 0,2g naatriumatsetaati ja loksutati. Reaktsioonisegu hoiti keevas veevannis 40 minutit, aeg-ajalt loksutades. Seejärel jahutati jäävannis. Tulemuseks olid kristallid, mida sai mikroskoobis vaadelda. Maltoosi lahusest saadud kristallid olid gruppideks kokku koondunud, teravate otsdega ja nagu lipsu kujulised . Laktoosi lahusest saadud kristallid olid samuti terava otsaga, aga pikemad , meenutasid ümmargust siili . Keskel olid kristallid tihedalt kokku põimunud, äärest tulid välja nagu teravad siili okkad.
Hõbepeegli reaktsioon
Taandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm redutseerib mitmete metallide sooli . Lahusest sadestub metall klaasi pinnale peeglina
Töö käik: Katseklaasi valati 1ml 1%-list AgNO3 lahust, lisati 0,5 ml kontsentreeritud NH4OH ja 1ml glükoosi lahust. Segu soojendati ettevaatlikult. Alguses lahus muutus hallikaks, seejärel tekkis katseklaasi seinale peegel.
Järeldus: Kuna katseklaasi pinnale tekkis peegel, siis järelikult on glükoos taandatav suhkur, mille aldehüüdrühm oksüdeerus metalliga.
Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahusega
Fehlingi reaktiiv saadakse CuSO4 vesilahuse ( Fehling I) ja leeliselise kaalium -naatriumnitraadi soola vesilahuse( Fehling II) kokkusegamisel. Saadud reaktiiv reageerib aldooside või ketoosidega. Sahharoosi hüdrolüüsi saab kiirendada kas ensümaatiliselt või happe toimel.
Töö käik: kahte katseklaasi valatakse 1ml sahharoosi lahust, ühte katseklaasi lisatakse 1 tilk kontsentreeritud HCl. Mõlemat lahust kuumutati 10 minutit veevannis ja mõlemale lisati seejärel Fehling I ja Fehling II lahust. Kuumutamisel tekkis katseklaasi, kuhu oli pandud HCl punane sade.
Järeldus: Punane sade tekkis, kuna vaba aldehüüdrühma toimel vask taandub, andes vask(I)oksiidi, mis moodustab punase sademe, suhkur ise oksüdeerub reaktsiooni käigus vastavaks happeks . Sade tekkis ainult happega katseklaasi, kuna sahharoos ise Fehlingi reaktiiviga ei reageeri, küll aga reageerivad tema hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos. Happe lisamine kiirendas sahharoosi hüdrolüüsi ja sellepärast tekkis happega katseklaasi punakas sade.
Barfoed’ reaktsioon
Suhkrute reaktsioon vaskatsetaadi lahusega äädikhappes ( Barfoed’ reaktiiv) võimaldab eristada mono- ja disahhariide, kuna happelises keskkonnas taandavad vaske üksnes monosahhariidid.
Töö käik: Kahte katseklaasi pipteeriti ühte 1 ml fruktoosi ja teise 1ml laktoosi. Lisati 3 ml Barfoed’ reaktiivi ja segati ning kuumutati veevannis 10 min. Fruktoosiga katseklaasi tekkis punakas sade, laktoosiga katseklaasi ei tekkinud.
Järeldus: Fruktoos on järelikult monosahhariid ja punane sade tekkis nende reaktsioonil Barfoed’ reaktiiviga, kui eraldus katseklaasi põhja vask(I)oksiidi sade.
Selivanoff’i reaktsioon
Suhkrute kuumutamisel moodustub pentoosidest heterotsükliline aldehüüd furfurool ja heksoosidest hüdroksümetüülfurfurool. Need ühendid reageerivad mitmealuseliste fenoolidega nt Selivanoffi’ reaktiiviga (soolhappe, 1,3-benseendiool, FeCl3 katalüsaatorina), andes värvilisi produkte. Ketoosidega toimub reaktsioon kiiremini.
Töö käik: ühte katseklaasi valati 1ml fruktoosi lahust, teise 1ml glükoosi. Lisati 2 ml Selivanhoff’i reaktiivi ja soojendati neid veevannis 10 min. Fruktoosi lahusega katseklaasis tekkis 1 min pärast õrn punane värvus ja 3 min pärast juba tugevalt punane. Glükoosi lahusega katseklaasis muutus värvus õrnalt roosakaks.
Järeldus: Fruktoosiga toimus reaktsioon kiiremini kui glükoosiga. Järelikult on fruktoosi puhul tegemist ketoosiga, kuna ketoosidega toimub reaktsioon kiiremini kui aldoosidega.
Tärklise reaktsioon joodiga
Tärklise omadus moodustada joodiga lillakas-siniseid komplekse on tingitud polüsahhariidide keerdumisest joodi molekuli ümber.
Töö käik: Katseklaasi valati 5 ml tärkliselahust ja lisati 1 tilk joodilahust. Reaktsioonisegu kuumutati. Lillakas värvus kadus . Seejärel asetati katseklaas jäävanni ja lillakas värvus taastus.
Järeldus: Kuumutamisel värvus kadus, kuna kõrgel temperatuuril kompleksid lagunevad ja toimub pöörduv reaktsioon. Jäävannis kompleksid taastusid ja taastus ka iseloomulik värv.
Joodiga värvunud terakesed olid hõlpsasti vaadeldavad ka mikroskoobis.
Maisi tärklise terad olid väiksemad kui kartuli omad. Kujult olid maisi terad kandilisemad kui kartuli omad, kartuli terad olid ümmargused.