maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 68,84 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42. Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t) Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 50 ml kuiva kolbi
Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Proovide ettevalmistamine ja sisestamine Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised. Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast. Kolonni elueerimine Enne voolustamise alustamist asetakse 100ml kuiv kooniline kolb väljalaskeava alla ja avatakse väljavool kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan.
Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 42,165/2≈21. Võtsin 21 kaliibritud katseklaasi Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle
elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 103,01 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53 · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiga koguda iga fraktsioon umbes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine: · Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin automaatpipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. · Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige
elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 82, 16665. · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 41,08. · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiks koguda iga fraktsioon ubmes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine: · Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. · Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige
näiteks peas ja tiibadel, nende ainete vastuvõtmiseks on loomadel erilised retseptorid ehk sensillid. 12. Vivipaaria eelised võrreldes ovopaariaga Kui loode kinnitub emase suguteede külge ja saab oma toitained ema vereringest, on tegemist vivipaariaga. Munevaid loomi nimetatakse ovopaarideks. 1. Vivipaarsete loomade embrüod on tõhusamalt kaitstud. 2. Ema on nö. kõndiv inkubaator, ei pea istuma pesal ja hauduma, saab hankida toitu. 13. Müoglobiin Müoglobiin on rauda ja hapnikku siduv valk, mida leidub selgroogsete lihaskoes. See on hemoglobiini monomeer. Inimestel satub müoglobiini verre ainult peale lihasvigastust. Müoglobiin on lihaskoe peamine hapnikku kandev pigment. Kõrge müoglobiini kontsentratsioon lihasrakkudes võimaldab loomadel kauem hinge kinni hoida. 14. Hüdrostaatiline skelett Vedelik kannab kehas paiknevate ring- ja pikilihaste kontraktsioonide poolt tekitatud rõhu muutused ühtlaselt üle kogu looma keha.
Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Proovide ettevalmistamine ja sisestamine Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised. Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast. Kolonni elueerimine Enne voolustamise alustamist asetakse 100ml kuiv kooniline kolb väljalaskeava alla ja avatakse väljavool kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan.
Geelisamba kõrgus L= 29,5 cm Kolonni sisediameeter 2,1 cm ( r= 1,05 cm) Vajalikud arvutused tööks Kogumaht Vt= Sp * L Sp= r2 Vt= 3,14 * (1,05)2 * 29,5 = 102 cm3 Geelimaatriksi maht Vg= k* Vt Vg= 0,1* 102 = 10,2 cm³ Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg Vxmax= 102-10,2= 91,8 cm3 Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/ 2 n= 91,8/246 katseklaasi Elueerimispuhver: 0,15 M NaCl; 20 mM Tris/HCl; pH= 7,5 Lahutatava segu koostis: dekstraansinine 3 mg/ml, müoglobiin 6 mg/ml, DNP- aspartaat 0,3 mg/ml Segu komponentide lahutamine kolonnis 1. Avasin alumise kraani ja lasin voolutil kolonnist tilkuda väiksesse keeduklaasi kuni vooluti oli mõne mm kõrgusel geeli nivoost, jälgides, et kolonn kuivaks ei jookseks. 2. Sulgesin kolonni väljavooluava ning doseerisin pipetiga geeli pinnale 1 ml uuritavat proovi. 3. Järgmiseks lisasin tilkhaaval voolutit, et proov imenduks geeli, kuid ei lahustuks voolutis. 4
Aktiini sisaldavad peened müofibrillid Inimese nahavärv oleneb: melaniinist, hemoglobiinist, karoteenist Toruluu osad: kasvuplaat, epifüüs, diafüüs Punased lihaskiud on vastupidavamad Kõige enam toodab ATPd molekuli glükoosi kohta glükoosist aeroobsel rakuhingamisel Skeleti funktsioonid: organismi toestamine, kangideks olemine kinnitunud lihastele, kaltsiumioonide varu säilitamine Reservhapniku seondumise kohaks on müoglobiin Luude reorganiseerumine toimub osteoblastide ja osteoklastide koordineeritud elutegevuse tulemusena Müosiini sisaldavad müofilamendid on jämedad Kolju luud: os temporale, os occipitalis, os parietale Müosiini peal on ATPaasne aktiivsus Vereloomega seotud terminid: punane luuüdi, hematopoees, käsnollus Inimese mediaansel sagitaalsel tasapinnal ei ole näha: kopse Aeglaste oksüdatiivsete lihastega seonduvad järgnevad sõnad: müoglobiin, reservhapnik, punane
V x - v xmin R f = max V x - V xmin Fraktsioonide arvutamine: r = 2,2/2=1,1 cm h = 31,5 cm Geeli maht: Vt = Sp*h = r2*h = *(1,1)2*31,5 =119,68 cm3 k = 0,1 Vg = k*Vt = 0,1*119,68 = 11,9 cm3 Vxmax = Vt Vg = 119,68 11,9 = 107,7 cm3 Fraktsioonide teoreetiline arv: n = Vxmax/2 =107,7/2 = 53 Kogusin kolonni väljavooluavast tilkuva eluaadi koonilisse kolvi ning hiljem mõõtsin ära vedeliku mahu: Vv = 34 ml Uuritav segu koosneb kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin ja DNA- aspartaat, elueerimispuhvriks oli pH=7,5 0,05M Tris/HCl. Kolonn sisaldab: Sefadex G-50 Lainepikkus Fraktsiooni Eluaadi Optiline (nm) nr maht (ml) tihedus 1 36 0,037 2 38 0,169 670 3 40 0,248 4 42 0,189 5 44 0,095 6 46 0,039
2) kolonni diameeter d= 2,4 cm. 3) Seejärel arvutatakse kolonni kogumaht Vt= r2h= 3,14*(2,4/2)*22,6=85,15 cm3 4) k=0,1 5) Seejärel arvutatakse geelmaatrikis maht Vg=k*Vt = 85,15*0,1=8,51cm3 6) Vg lähtuvalt arvutatakse max elueerimismaht Vx max=Vt-Vg=85,15-8,51=76,64 cm3 7) Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml, seega n= Vx max /2= 76 /2=38 Esimese elueerimismaht oli 15 ml Optilise tiheduse table Dekstraansinine Müoglobiin DNP-aspartaat 670nm 410 nm 360nm 0,011 0,129 0,166 0,335 0,612 0,542 0,484 1,683 1,555 0,329 1,999 2,636
TÖÖ KÄIK, ARVUTUSED, TABELID, GRAAFIKUD Fraktsioonide arvutamine: r = 2,3/2=1,15 cm h = 29,5 cm Geeli maht: Vt = Sp*h = r2*h = *(1,15)2*29,5 =122,56 cm3 k = 0,1 Vg = k*Vt = 0,1*122,56 = 12,256 cm3 Vxmax = Vt Vg = 122,56 12,256 = 110,30 cm3 Fraktsioonide teoreetiline arv: n = Vxmax/2 =110,3/2 = 55,15 Kogusin kolonni väljavooluavast tilkuva eluaadi koonilisse kolvi ning hiljem mõõtsin ära vedeliku mahu: Vv = 27 ml Uuritav segu koosneb kolmest komponendist: dekstraansinine 3mg/ml, müoglobiin 6mg/ml ja DNA-aspartaat 0,3mg/ml, elueerimispuhvriks oli pH=7,4 20mM Tris 0,15M NaCl Kolonn sisaldab: Sephadex G-75 Lainepikku Fraktsiooni Eluaadi Optiline s (nm) nr maht tihedus (ml) 1 36 0,007 2 38 0,067 670 3 40 0,160 4 42 0,248 5 0,180
kolonnist väljuvad kõige suuremad molekulid (=). Maksimaalne elueerimismaht selline elueerimismaht, mille juures kolonnist väljuvad ka need molekuli, mille molekulid täielikult diffundeeruvad geeli pooridesse (=). Aineid, mille molekuli suudavad täielikult diffundeerida geeli pooridesse ja mille antud kolonnis on teada, iseloomustatakse liikuvusteguriga : Selle värtusedjäävad vahemiku 0...1 Töö käik 1. Proovi andmed: =0.5 ml. Koostis: Dekstraansinine (6 mg/ml), Müoglobiin (6 mg/ml), DNP-aspartaat (0.3mg/ml), proovi lahusti ja eluent NaCl lahus. 2. Märgin ära kolonni andmed: geel on Sephadex G-75, koeffitsient k=0.1, geelisambla kõrgus L=27.4 cm, diameeter d=1.9 cm. 3. Arvutan vajalikud mahud: ; ; 4.Arvutan fraktsioonide üldarv: n= (tegelikult 29-s fraktsioonis oli nii vähe elueerivat ainet, et sellega ma lõpetasin fraktsioonide kogumist). 5. Asetan katseklaase statiivi ja nummerdan neid. 6
Valkude ruumiline struktuur 1. Valkude struktuuri määravad faktorid 2. Valkude sekundaarstruktuur 3. Valkude tertsiaarstruktuur 4. Valkude kvaternaarstruktuur 5. Valkude struktuuri näiteid: RibonukleaasA, Müoglobiin, Hemoglobiin, Insuliin Valkude struktuur? · Bioloogiliste makromolekulide struktuur kirjeldatakse erinevatel tasanditel PRIMAARSTRUKTUUR. Aminohappe jääkide lineaarne järjestus · primaarstruktuur · sekundaarstruktuur · tertsiaarstruktuur · kvaternaarstruktuur heeliks leht
NB! Õhk ei tohi tungida geelikihti! 4. Kasutan kalibreeritud mõõtpipetti ja viin 1 ml uuritavat proovi kolonni. 5. Lasen proovil tilkuda geeli pinnale nii, et see jaotuks seal võimalikult ühtlaselt. NB! Samal ajal on väljavooluava suletud! Praktikumis uuritavas ainete segus on kõik ained värvilised ja segu komponentide lahutamine on visuaalselt jälgitav. Uuritava segu sisaldus: dekstraansinine + müoglobiin + DNP-aspartaat KOLONNI VOOLUTAMINE: 1. Avan väljavoolu kolonnist 2. Hakkan koguma eeljooksu (puhas vooluti), enne kui kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent (dekstraansinine). 3. Kui proov on täidisesse sisenenud, viin kiiresti pipeti abil geeli pinnale väikese koguse (0,5-1 ml) eluenti 4. Lasen eluendil täidisesse imbuda. 5. Kordan seda protsessi väikeste kogustega seni, kuni kogu uuritav proov on kolonni sisenenud 6
V g = k * Vt = 7,986 V x max = 79,86 - 7,986 = 71,874 71,874 n= = 35,957 36 2 Sain siis, et fraktsioonide üldarvuks tuleb 36. Seejärel eemaldasin kolonni ülaosast üleliigse vedeliku lastes sel voolata mööda kolonni väiksesse keeduklaasi. Kui vedeliku nivoo oli geelisambaga peaaegu samal kõrgusel ( umbes 2mm kõrgemal) siis sulgesin kraani ja doseerisin pipetiga geelisamba pinnale 0,5ml uuritavat proovi. Proov koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin ja DNA-aspartaat. Seejärel keerasin kraani vaikselt tilkuma ja panin sinna alla kolvi. Kui uuritav proov oli geeli imendunud, lisasin natuke juurde puhvrit, seejärel uuesti väikese koguse ja lõpuks lisasin rohkem, et puhvri maht ulatuse kolonni ääreni. Lasin eluaadil kolbi tilkuda seni, kuni esimene värviline riba ( sinine) jõudis kolonni põhjani ja eemaldasin siis kolbi ja kogusin edasi vedelikku fraktsioonidena nummerdatud ja kaliibritud(2ml) katseklaasidesse
Kui vedeliku tase kolonnis oli langenud täidise pinnani, sulgesin väljavooluava. Nüüd oli kolonn valmis proovi sisestamiseks. Proovi sisestamine Võtsin pipetiga 1 mL uuritavat proovi ja viisin selle kolonni. Selleks juhtisin pipeti otsa vastu kolonni seina ja lasin proovil voolata geeli pinnale nii, et geel saaks võimalikult ühtlaselt kaetud. Uuritav segu Uuritav segu koosnes kolmest erineva molekulmassiga komponendist. Uuritava segu koostisosad: 1) Dekstraansinine, 3 mg/mL 2) Müoglobiin, 6 mg/mL 3) DNP-aspartaat, 0,3 mg/mL Kolonni voolutamine Kui olin proovi viinud geeli pinnale, siis avasin väljavoolutoru ja hakkasin eluaati koguma alguses ühendatud fraktsioonina kuiva kolbi. Niipea kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin pipeti abil geeli pinnale väikese koguse voolutuslahust ja lasin sellel täidisesse imbuda. Kordasin sama asja väikese eluendi kogusega veel teinegi kord ja siis viisin juba geeli pinnale nii palju eluenti, et moodustus u 5 cm kõrgune kiht.
· geelisamba kõrgus l = 31,4 cm · diameeter d = 1,6 cm · täidise kogumaht Vt = 63 ml · geelimaatriksi maht Vg = 0,1 63 = 6,3 ml · maksimaalne elueerimismaht Vxmax = 63 6,3 = 56,7 ml · fraktsioonide üldarv n = 56,7 / 2 = 29 · statiivi võetakse vastav arv katseklaase · eluendi koostis: 50nM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH = 7,5 · uuritav segu: o dekstraansinine (6mg/ml) o müoglobiin (6mg/ml) o 2,4-dinitrofenüülaspartaat (0,6mg/ml) · kolonni täidise pinnal olev eluent lastakse välja · kolonni voolukiirus reguleeritakse piiridesse 0,7 1,0 ml/min · kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava · kolonni pipeteeritakse 0,5 ml uuritavat proovi, lastes proovil geelile mõne millimeetri kõrguselt tilkuda nii, et proov jaotuks geelis ühtlaselt
difundeeruda ja mille elueerimismaht on kindlaks määratud. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Kromatogramm graafiline sõltuvus aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahel Töö käik Esmalt märkida üles vajalikud andmed ning teha arvutused Täidise mark: Sephadex G75 Täidist iseloomustav pundumistegur k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 25,5 cm Kolonni sisediameeter d= 1,6 cm r= 0,8 cm Voolutuslahuse koostis: 0,15M NaCl Proovi koostis: Dextrane blue 6mg/ml, Müoglobiin 6mg/ml, DNP-aspartaat 0,3mg/ml Arvutasin välja: Vt = r2 * L= 3,14 * 0,64 * 25,5 = 51,27 cm3 Vg= k*Vt = 0,1 * 51,27 = 5,127 ml Vx max = Vt Vg = 51,27 5,127 = 46,143 ml N= Vx max /2 = 46,143 /2 = 23,1 tk Pärast ettevalmistuste tegemist avada ettevaatlikult kolonni voolutusava ning kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, siis taas sulgeda kolonni väljavooluava. Kolonn on valmis proovi sisestamiseks.
L=32,5 cm. d=1,9 cm. · Arvutan täidise kogumaht Vt . · Arvutan geelimaatriksi maht Vg . · Arvutan kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutan fraktsioonide üldarv n, arvestades, et ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml. n= Vxmax/2 =82,89/2=41,445=~42 · Katseklaasistatiivi asetan fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan. · Voolutuslahus:Dekstraansinine,Müoglobiin,DNP-Aspartaat.Kasutasin automaatpipetti mahuga 0,5 ml. · Kolonni pinnal olev eluent kogun seisukolbi. Segu komponentide lahutamine: Avan kolonni väljavooluava. Täidise lahus hakkab keeduklaasi tilkuma. Reguleerin kolonni voolukiirus piiridesse 0,7-1,0 ml/min. Kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletan kolonni väljavooluava . Uuritav segu: 1.segu: Dekstraansinine (sinine), müüoglobiin (punane), DNP-aspartaat (kollane). Proovi sisestamine:
TULEMUSED JA NENDE INTERPRETATSIOON Täidise mark SEFADEX G-75 Pundumistegur k 0,1 Täidise kõrgus L 31,5 cm Kolonni sisediameeter d 1,8 Täidise kogumaht ( ) Geelmaatriksi maht Maksimaalne elueerimismaht Fraktsioonide üldarv Dekstraansinine Uuritav segu Müoglobiin DNP-aspartaat pH 7,5 Elueerimislashus 0,05 M Tris/HCl 0,1 M NaCl Laine- Fraktsiooni Eluaadi Optiline pikkus järjekorra maht V tihedus (nm) nr (ml) Ühendfrakt. 23,5 0
· Täiesti värvusetute fraktsioonide optilised tihedused võrduvad 0-ga ja neid pole vaja mõõta. · Saadud tulemustest koostatakse katseandmete tabel ja selle alusel kromatogramm. Kolonni iseloomustavad parameetrid · Geel: Sephadex G 75 , fraktsioneermispiirkond 3000 80000 Daltonit · Geeli pundumistegur: k = 0,1 · Täidise kõrgus L = 31.5 cm · Kolonni sisediameeter: d = 2,1 cm Proovi komponendid · Dekstraalsinine (6mg/ml) · Müoglobiin (6mg/ml) · DNP aspartaat (0,6 mg/ml) Mõõtmis- ja arvutamistulemused 1. Kolonni täidise maht Vt 2. Geelmaatriksi maht Vg 3. Kolonni maksimaalne elueerimismaht Vx,max 4. Fraktsioonide üldarv n. 5. Mõõtmistulemuste tabel Optiline Fraktsiooni Elueerimisma tihedus number ht V, ml
24 67,5 0,975 360 25 69,5 0,484 360 26 71,5 0,186 360 27 73,5 0,056 360 28 75,5 0,033 360 C. Kromatogrammilt: Komponentide elueerumisprofiilid: Dekstraansinine (: A = 0,400; eluaadi maht V = 25,5 ml Müoglobiin (: A = 3,0; eluaadi maht V = 33,5 ml DNP-aspartaat (: A = 1,364; eluaadi maht V = 65,5 ml Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine, mis tõestab, et sellel on kõige suurem molekulmass. Tänu sellele ei difundeerunud ta geeli pooridesse, vaid väljus kolonnist graanulite vahelt minimaalse elueerimismahuga, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vxmin = 25,5 ml.
milles järeldub lahuse optiline tihedus. Tulemuste põhjal koostati kromatogramm. Tulemused ja nende analüüs Täidise mark: SEPHADEX G-75 Pundumistegur k = 0,1 Täidise kõrgus L = 32,5 cm Kolonni diameeter d = 2,1 cm r =1,05 Täidise kogumaht: Vt= ·r2·L = 3,14 · 1.052 · 32,5 = 112,5 cm3 Geelmaatriksi maht: Vg= 0,1 · 112,5 = 11,25 cm3 Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = 112,5 11,25 = 101,26 cm3 Fraktsioonide üldarv: n=101,26 : 2 = 50, 63 51 Uuritav segu: Dekstraansinine 3mg/ml Müoglobiin: 5mg/mol DNP-aspartaat: 0,3 mg/mol Elueerimislahus: pH= 7,4 20 mM Tris/HCl 0,15 M NaCl Fraktsiooni nr Lainepikkus, nm Elueerimismaht V, Optiline tihedus, ml A Ühendatud fraktsioon - 23 0 1 670 25 0 2 670 27 0,032
Kui vedeliku tase langes kolonnis täidise pinnani, sulgesin kolonni väljavooluava ja kolonn sai valmis proovi sisetamiseks. 1.4 Proovi sisestamine Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin pipetti. Viisin 0,5 ml uuritavat proovi kolonni, juhtides pipeti otsa vastu kolonni seina. Proovil lasksin voolata geeli pinnale nii, et see jaotuks võimalikult ühtlaselt. 1.5 Uuritavad segud Uuritav segu koosnes järgnevatest ainetest: Dekstraansinine ( 6 mg/ml ) Müoglobiin ( 6 mg/ml ) DNP aspartaat ( 0,6 mg/ml ) 2.4 Kolonni voolutamine Kui proov on täidisesse sisenenud, viin pipetiga geeli pinnale väikse koguse voolutuslahust ja lasen täidisesse imbuda. Kordan seda nii kaua, kuni kogu uuritava proov on kolonni sisenenud ja siis võib geeli pinnale kanda suurema hulga voolutit. Kui esimene värviline riba ( dekstraansinine ) läheneb kolonni põhjale, siis eemaldab
2.Puutetundlikkuse häire tekkimine 3.Jala funktsioonihäire tekkimine operatsiooni järgselt - ei suuda sirutada varbaid ( n. peronealise kahjustus) 3-4 tundi funktsiooni häiret survesündroomist on juba taastumatu ! Püsiva surve sündroom ja reperfusiooni sündroom ehk verevoolu taastamise järgselt tekkida võiv üldine eluohtlik jääkainete ja happesuse tõus. Organismile mürgised jääkained ja müoglobiin liiguvad verega neerudesse Tume “paks” uriin!! Operatsiooni haava, dreenide jälgimine. “Vaata teki alla ka” Läbimärg haavaside tuleb vahetada infektsiooniohu vähendamiseks. Turses jäseme piirkonnas väldi plaastri kasutamist- kasuta sidet Dreen pannakse jälgimiseks või raviks ja see töötab vaid siis kui süsteemi toimimist ei takista välised takistused Opereeritud jäseme jälgimine. Vaata haiget üle võttes opereeritud jäset ja haava!
LIHA Eesti süüakse põhiliselt sea, veise ja linnuliha, harvemini lamba, kitse ja ulukiliha. Üliharva ka hobuseliha. Liha põhikoostisosad on vesi, valgud, rasvad ja mineraalained. Liha sisaldab ka vitamiine, mikroelemente ja ekstraktiivaineid. Süsivesikuid on lihas vähe. Liha koostis varieerub sõltuvalt lihalooma liigist, tõust, soost, vanusest, toitumusest ja üldseisundist. MIDA MÄRJEM, SEDA LAHJEM Värske lihaskude sisaldab 7075% vett ja 2530% kuivainet. Kuivatamisel, soolamisel, külmutamisel, suitsutamisel ja teistel töötlemisviisidel väheneb liha veesisaldus üsna suurel määral. VIIENDIK LANGEB VALKUDELE Liha koostisosade koguhulgast moodustavad valgud kuni 20%. Lihavalkudes on meile vajalikud asendamatud amiohapped sobivas vahekorras. Loomsed valgud seeduvad taimsetest paremini, aga samas aitavad ka taimsetel valkudel paremini seeduda. See on normaalse segatoitumise alus. RASVA POLE VAJA...
Töö käik: Peenestasime käsitsi väherasvase sealiha ning kaalusime kummassegi keeduklaasi umbes 5 g peenestatud liha. Ühe keeduklaasi lihaga panime keevale vesivannile ning kuumutasime seda klaaspugaga pidevalt segades 10 minutit. Jälgisime liha värvuse muutumist. Enne kuumutamist oli liha roosaka värvusega ning hakkas kohe kuumutamise alguses muutuma beezikaks. 10 minuti möödudes oli liha pruunika-beezi värvusega. Müoglobiin on lihaskiudude valk, mis annab toorele lihale värvuse, värvuse muutumise põhjustab müoglobiini denaturatsioon. Seejärel viisime nii toore kui ka kuumutatud liha proovid 50 ml vee abil koonilisse kolbi ning loksutasime neid käsitsi kolbides 10 minutit. Sel viisil saadud toore ja termiliselt töödeldud liha vesiekstraktid filtrisime läbi paberfiltri ülejäänud kahte koonilisse kolbi. Järgnesid toorelt
raud vask tsink mangaan koobat jood molübdeen vanaadium Bio- Hemoglobiin Hemoglobiini Ensüümide kofaktor, Ensüümide Vereloome, Kilpnäärme Ensüümide Luude, kõhre, funktsioonid , müoglobiin, süntees, epidermise areng, kofaktor, eretrotsüütide ensüümid, valkude kofaktor, hammaste areng, ensüümid, luukoeteke, immuunsüsteemide kolesterooli funktsioon süntees, kilpnäärme luukoe teke ja hemoglobiini ja
10. loeng Lihaskude Lihaskude · Erinevad lihaskoe liigid tekivad mesodermi erinevatest osadest (ainult müoepiteliaalsed rakud mõnedes näärmetes ja silma vikerkesta lihased on ektodermaalset päritolu) · Lihasrakud on väljavenitatud, pikitelg on kokkutõmbumise suunas · Kokkutõmbumise kandjateks on müosiinist ja aktiinist müofilamendid · Lihaskoe rakkude tunnuseks on mitokondrite suur hulk, inklusioonidest esinevad glükogeen ja müoglobiin Lihaskoe klassifikatsioon · Eristatakse kolme struktuurselt ja funktsionaalselt erinevat lihaskoe tüüpi 1) silelihaskude- ristivöötsus puudub 2) skeletilihaskude - ristivöötsusega, tahtele alluv 3) südamelihaskude- ristivöötsusega, tahtele allumatu · Paralleelsed terminid tsütoplasma = sarkoplasma plasmalemm = sarkolemm endoplasmaatiline retiikulum = sarkoplasmaatiline retiikulum
grillimine Raud ja lihatoodete värvus Tailihas on rauda ~2 mg/100g, palju rohkem on keeles (38 ) ja maksas (28), palju on ka maasikates ja kaunviljades Punane liha sisaldab rauda 2-4 korda rohkem kui valge liha. Mida suurema hapnikuvaruga töötab lihas, seda tumedam (hülge ja vaalaliha on väga tume) Lihatoodete värvus Seostunud ühend Värvus Nimetus Fe++ kovalentne :H2O purpur müoglobiin :O2 helepunane oksümüoglobiin :NO roosakas nitroso-müoglobiin :CO punane karbolsü-müoglobiin Fe+++ iooniline -CN punane tsüanomüoglobin -OH pruun metmüoglobin -SH roheline sulfomüoglobin
visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldavad praktikumis uuritavad segud dekstraansinist(6mg/ml), mis elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saame teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv ). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2·106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Teine komponent oli valk müoglobiin(6 mg/ml), mille neeldusmaksimum on lainepikkusel 410 nm. Müoglobiinil on helekollane värv. Tema molekulmass on 16 800 g/mol.Müoglobiin on väga tähtis inimese kehas, kuna ta on skellet- ja südamelihase hapnik-siduv valk. Kolmas komponent, millel on kõige väiksem molekulmass oli DNP aspartaat, so asparagiinhappe dinitrofenüülderivaat (0,6 mg/ml). Seda kasutatakse selleks, et ainete lahutamise piir oli nähtav, kuna DNP-aspartaadi lahusel on kollane värv.
ämblikuvõrgus, villas jne. Ei lahustu vees. 3. Kolmandane , esinevad kõik sidemed a) gloobul (pusa moodi) - vesilahustuv, antikeha, transportvalk, ensüüm b)fibrill (sinkavonka) - lihasvalgud vees ei lahustu Näited: a) vesiniksidemed b) Väävlisillad c) ioonsed sidemed + ja - aminohapete radikaalid d) hüdrofoobsed sidemed 4. Neljandane struktuur Koosneb mitmest omavahel seostunud valgulisest ehitusüksusest (erinevad lindid pusas), nt hemoglobiin, müoglobiin veeloomades, ensüümkompleksid. Esinevad kõik sidemed Valkude füüsikalis-keemilised omadused 1. Suur molekulmass, normaaltingimustes biomembraane ei läbi, kui nt uriinis tuvastatakse valk, on viga neerudes. 2. Valgud kas lahustuvad vees (piim, muna, veri) või ei lahustu (juuste, naha, sülgede, soomuste, küünte). Kui piimas on vesi, saab sellest aru külmutades. 3. Hüdrolüüsuvus, hüdrolüüsuvuse tagajärjel tek vabad aminohapped, nt seedumine 4
Siirdemetallidest tähtsaim biometall, oluliseks peetakse rauaühendite kahte funktsiooni: 1) O2/CO2 transporti organismis ja O2 salvestamist, 2) elektronide transport redoksprotsessides. vereloome jm bioprotsessid Praktiliselt kogu Fe(98%) on jaotunud organismis nelja rühma kuuluvate valgulise iseloomuga ühendite vahel. Hemoglobiinis (Hb) on peamine Fe kogus (65%). Vere punalibledes sisalduv pigment Hb kannab õhuhapnikku kopsudest kudedesse ja CO2 kudedest kopsudesse. Müoglobiin on kromoproteiid, mis salvestab nii selgrootute kui ka selgroogsete organismide kudedes hapnikku. Müoglobiin seob hapnikku pöörduvalt. Tsütokroomid kuuluvad kromoproteiidide hulka. Need on valgustneelavad pigmendid, mis toimivad redokssüsteemides elektronide vaheülekandjatena. Protsessi käigus muutub raua oksüdatsiooniaste. Tsütokroomid esinevad loomorganismides ja mikroobides, valdavalt anaeroobsetes. Ferritiin on organimisi rauasalvesti. Teiseks rauadepooks on hemosideriin
tiheduse kaudu, mida mõõdeti aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetriga. Tulemused Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv: Uuritava segu koostis: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl 2 Mõõtmistulemuste tabel Fraktsiooni number Elueerumismaht V (ml) Optiline tihedus (A) Ühendatud fraktsioon 25 0 1 27 0,042 2 29 0,2026 3 31 0,1868
· Liitvalgud ehk proteiidid koosnevad valgulisest ja mittevalgulisest komponendist: a) Nukleoproteiidid mittevalguline osa on nukleiinhape (RNA, DNA) b) Fosforproteiidid - sisaldavad fosforhappejääki. Nende hulka kuulub piima kaseiin. Kaseiinid on temperatuuri huhtes püsivad, kuid sadestuvad kergesti hapete toimel. Liitvalgud c) Kromoproteiidid mittevalguline osa on värvaine. Tuntuimad on hemoglobiin ja lihastele punase värvi andev müoglobiin. d) Glükoproteiidid sisaldavad glükoosijääki e) Lipoproteiidid sisaldavad rasvhappejääki Valkude ehitus · Valkude ehituses eristatakse neli struktuuritasandit: 1) Primaarne str näitab ära valkude aminohappelise järjestuse 2) Sekundaarna str iseloomustab valgu polüpeptiidahela keerdumist -heeliksiks või paigutust ß-struktuuriks mõlema puhul on AH-d valgu sees seotud vesiniksidemetega.
Reguleerida tuli ka voolukiirus 0,5-0,8 ml/min. Hiljem, kui siniselt värvunud molekulid olid geelist läbi tulnud, võis kiirust lisada. 2. Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 0,5ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas. 3. Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama, puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. 4. Lisasin puhverlahust, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Arvutused:
· Fraktsioonide arv n = 25 Kromatogramm · Teades, et komponentideks olid: 1. Dekstraansinisest 3mg/ml, Mr = 2 · 106 2. Müoglobiinist 6mg/ml, Mr = 1,7 · 104 3. DNP aspartaadist 0,3mg/ml Kuna sinine desktraansinine voolas läbi kolonni kõige kiiremini võib järeldada, et tema molekulmass on suurim. Kahjuks ma DNP aspartaadi molekulmassi ei tea, mistõttu on keeruline oletada, kumb väljus kolonnist enne, kes müoglobiin või DNP aspartaat. · Eluaadi maht dekstraansinise kõrgema kontsentratsiooni hetkel Vxmin = Vv = 31,5ml · Kuna ma OPN aspartaadi molekulmassi ei tea siis oletan, et ONP aspartaadi molekulmass on väiksem. Vx = 26ml · Kolonnist viimasena väljunud komponendi kõrgeima konsentratsiooniga fraksioon Vx1max = 57,5ml · Vx1max = 57,5ml Vxmax = 65,357 tõenäoliselt on see viga tekkinud, kas kolonni mõõtmisel või
Lõpuks kui kõik värvilisi fraktsioone enam ei tule võib võib prooide kogumise lõpetada. Tulemused ja nende interpreteerimine A. Täidise mark ja materjal=> Sephadex, 675 Täidist iseloomustav pundumistegur=> 0,1 Täidise kõrgus=> 12,5 cm Täidise sisediameeter=> 2,7 cm Täidise kogumaht=> 71.53 cm3 Maksimaalne elueerimismaht=> 64,38 cm3 Fraktsioonide üldarv=> 32,19 B. Kromatogramm A- Müoglobiin B- D-aspartaat C- dekstraansinine V A B C 15,45 0 0 0 17,45 -0,0251 -0,0313 -0,0139 19,45 -0,0271 -0,033 -0,0164 21,45 -0,0168 -0,0225 -0,0055 23,45 0,0718 0,061 0,0783 25,45 0,03087 0,2615 0,2761 27,45 0,03448 0,2845 0,299 29,45 0,1667 0,1349 0,1509 31,45 0,0651 0,0401 0,0522
visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldavad praktikumis uuritavad segud dekstraansinist(6mg/ml), mis elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saame teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv ). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2·106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Teine komponent oli valk müoglobiin(6 mg/ml), mille neeldusmaksimum on lainepikkusel 410 nm. Müoglobiinil on helekollane värv. Tema molekulmass on 16 800 g/mol.Müoglobiin on väga tähtis inimese kehas, kuna ta on skellet- ja südamelihase hapnik-siduv valk. Kolmas komponent, millel on kõige väiksem molekulmass oli DNP aspasrtaamaspartaat, so asparagiinhappe dinitrofenüülderivaat t(0,6 mg/ml)
tugev alus/hape). Valk ei täita oma fuktsioone. Valkude renaturatsioon kõrgemat järku struktuuride taastumine. On võimalik, kui denatureeriv faktor ei olnud tugev , toimis vähe aega, kui primaarstruktuur on elav. Valkude hüdrolüüs peptiidsidemete lõhkumine ehk primaarstruktuuri lagunemine (hapetes keetmisel). Inimese maos toimub pepsiini abil HCl keskkonnas. 3. Individuaalsed valgud hemoglobiin ja müoglobiin. Heem tähtsain komponent on Raud. Ioniseeritud raud annab koordinatiivseid sidemeid. Üks nendest tekib O2 vaba elektroonpaari osalusel ja sel viisil seobki Hb transporditava molekulaarse O2. 3.1 Müoglobiin sisaldub lihastes. Omab tertsiaalse struktuuri (1 polüpeptiidahel). Mb omab 1 heemi grupp, 1 heem soib 1 hapnikumolekuli. Kuna sidumise sõltuvus O2 partsiaalrõhust on
järgu struktuur moodustab kindal järjestusega paigutunud aminohapetest koosnevatest petiidahelatest, mis omakorda seostuvad omavahel ristsidemetega. Näiteks:hemoglobiini molekulis, mis koosneb kolmesjast aminohappe jäägist. Sekundaarne struktuur – ehk 2. Järgu struktuur iseloomustab valgu molekuli ruumilist paigutust. Tersiaaalne struktuur – ehk 3. Järgu struktuur tekib ahelate üksteisest läbipõimumisel, kusjuures moodustuvad globulaarse kujuga molekulid.(müoglobiin). Kvaternaarne struktuur – ehk 3. Järgu struktuur formeerub mitme markomolekuli ühinemisel üheks kompleksseks gloobuliks. Hemoglobiini korral võtavad osa üksikute alaühikute globulaarpindadel paiknevate aktiivste rühmade vahel toimivad elekrostaatilised jõud. 2.) Denaturatsioon ehk denatureerimine (kunstladina denaturare 'loomulikest omadustest ilma jätma') tähendab biopolümeeride, peamiselt valkude omaduste
Oluline oli mitte kolonni lasta kuivaks joosta, sest muidu tungib õhk geelikihti. Kasutatud kolonnil oli automaatselt reguleeritud kiirus. 2. Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 1ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas. 3. Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama, puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. 4. Kogusin eelfraktsiooni mõõtkolbi, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogutud eelfraktsiooni mahu mõõtsin mõõtsilindri abil. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende
- nälgimine, dieet; - oksendamine, diarröa; - tugev füüsiline koormus. Ravimitest tingitud spetsiifilised lõhnad. 6. Värvus: normaalselt kollane (tingitud kollasest pigmendist urokroomist). Tumekollane-pruun: bilirubiin, biliverdiin (bilirubiini oksüdeerumisel tekkiv ühend, annab uriinile roheka varjundi), urobiliin; Punane: hemoglobiin, erütrotsüüdid, müoglobiin, porfüriinid; Pruun: hemoglobiin, müoglobiin; Oranz: bilirubiin, urobiliin, medikamendid. 7. Erikaal: normaalselt: 10151025. Isostenuuria: erikaal püsib 1010 (valguvaba plasma erikaal) Hüpostenuuria: <1010. - 8. pH: normaalselt 4,58,0. C. Uriini keemiline uurimine 9. Testriba Testriba on plastikriba, mille peal on reaktiividega immutatud padjandid.
ml eluaadi. · Elueeritud segus oli: 1) Dekstraansinine. Absorbeerib lainepikkusel 670 nm(sinie joon kromatogramil). Temal on sinine värvus ja ta väljub kolonnist esimesena, sest dekstraansinine on kõrgmolekulaarne(suured molekulid), mille tulemusena molekulid ei mahu geeligranulite pooridesse ja liikuvad kiiresti nende vahel. Kromatogrammi järgi me näeme,et dekstraansinise elueerimismaht V1 min=24ml 2) Müoglobiin. Absorbeerib lainepikkusel 410nm. Pruun värvus. Väljub teisena, kuna tol on väiksem molekulmass kui dekstraanil.V2=34ml 3) DNA DNP-Aspartaat. Absorbeerib lainepikkusel 360 nm. Kollane värvus. Väljub viimasena, kuna temal on kõige väiksem molekullmass, ja molekulid hästi mahuvad pooridesse, mis pidurdavad nende liikumist.V3max=74 ml.... Kui kõik on õigesti tehtud siis V3max ja arvutatud Vxmax peavad kokku langem. Arvutatud Vxmax on 74,9
Kontsentratsioon, A 0.8 0.6 0.4 0.2 0 20.65 30.65 40.65 50.65 60.65 70.65 80.65 90.65 Eluaadi maht, ml Esimesena väljus dekstraansinine, mille kontsentratsioon on üsna väikene. Kuna see väljus esimesena, siis on ka tegu kõige suurema molekulmassiga ainega. Teisena väljus müoglobiin, mille kontsentratsioon on juba ligikaudu 10 korda suurem. See väljus kolonnist teisena, mis tähendab, et selle molekulmass on väiksem dekstraansinisest, aga suurem DNP-aspartaadist. Viimasena väljus DNP-aspartaat, mille kontsentratsioon on enam-vähem sarnane müoglobiinile. Viimasena väljununa on selle aine molekulmass kõige väiksem. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsioonini (kaasa arvatud on) Vxmin = Vv = 24,65 ml
DNP-aspartaat on väikseima molekulaarmassiga ning ta difundeerus täielikult pooridesse ja läbis seetõttu kolonni kõige aeglasemalt. Kuna geelkromatograafia põhimõtte on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi, siis järeldan ka, et ma ei tegelenud praktikumis mustkunstiga ning sain ootuspärased tulemused, kus kõige suurema molekulmassiga aine väljus esimesena ning kõige väiksema molekulmassiga väljus viimasena. Dekstraansinine 200 kDa, müoglobiin 16 800 Da ja DNP- aspartaat 299,5 Da. Antud geeli lahutuspiirkond on 3000-80000 Da. Eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx=32 ml Katseliselt sain Vxmax 58 ml, mis sobib arvutuslikult saadud 59,7 ml-ga. Liikuvusteguri Rf väärtus müoglobiini jaoks: Rf= =0,22
5 Optiline tihedus (A) 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Eluaadi maht (V,ml) Graafik 1. Kromatogramm Järeldus Kromatogrammi pealt on näha kolm tippu, mis seletab ainete kolonnist väljumise järjekorda. Esimesena väljus kõige suurema molekulmassiga aine – dekstraansinine, seejärel müoglobiin ning siis väikseima molekulmassiga aine – DNP-aspartaat. Dekstraansinise molekulid ei mahtunud kolonni täitva geeli pooridesse. Müoglobiini molekulid difuneerusid geeli pooridesse rohkem ning DNP-aspartaadi molekulid difundeerusid geeli pooridesse täielikult. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni – Vxmin = Vv = 31ml Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 39 ml
üleliigne lämmastik; kasutatakse ka valkude denatureerimiseks? Anfinseni eksperiment – Anfinsen tõestas eksperimentaalselt, et denatureeritud natiivsed valgud taastavad iseeneslikult(!) oma natiivse konformatsiooni, kui denatureerivad ained eemaldada. Järeldus: info valkude õigete sekundaar- ja terstiaalstruktuuride moodustamise kohta peab sisalduma juba primaarstruktuuris e. primaastruktuuri järgi peab olema võimalik tuletada valgu ruumilist struktuuri (aga ei osata...veel). Müoglobiin ja hemoglobiin – mõlemad on heemi prosteetilise rühmana sisaldavad valgud ja füsioloogiline tähtsus seisneb võimes siduda hapnikku (heem otseselt seotud hapnikuga). Müoglobiin esineb lihasrakkudes, hemoglobiin erütrotsüütides. Hemoglobiinis on neli heemi, müoglobiinis üks. Iga heem seob ühe O2 molekuli. Allosteeriline effektor – molekul, mis mõjutab ensüümi aktiivsust, seondudes allosteerilisse saiti (mitte aktiivsaiti, st. ei konkureeri substraadiga)
Materjal: dekstraan Täidise kõrgus L = 33 cm Täidise diameeter d = 1,8 cm ; r = 0,9 cm Täidise kogumaht Vt = r 2 L = 0,9 2 33 = 83,98cm3 Geelmaatriksi maht Vg = k Vt = 0,1 83,98 = 8, 40cm3 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt - Vg = 83,98 - 8, 40 = 75,58cm3 Fraktsioonide üldarv V max 75,58 n= x = = 37, 78 38 2 2 Voolutuslahuse koostis 50 mMTris-HCl 150 nM NaCl pH = 7,5 Uuritava proovi koostis Dekstraansinine (sinine) Müoglobiin (pruun) DNP-aspartaat (kollane) Töö kolonniga Kõigepealt avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et voolutuslahuse nivoo oleks võrne täitegeeliga. Samal ajal reguleeritakse kolonni voolukiirus reguleerimisklambri abil õigeks (soovitav voolukiirus 0,7-1,0 ml/min, millele vastab 1 tilk nelja sekundi jooksul). Voolutuslahus kogutakse väiksesse keeduklaasi ja visatakse pärast minema. Seejärel lisatakse kolonni uuritav proov.
annaabi.ee 
