Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Teooria Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi. Erineva molekulaarmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise poorse geeli erineva kiirusega. Meetodit kasutatakse makromolekulide lahutamisel ja proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil.
Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis ­ kolonnis , mis on täidetud pundunud geelikraanulitega, mille pooride suurus on võrreldavad lahuses sisalduvate makromolekulide suurusega.
Kolonnis kasutatavad geelid koosnevad, kas dekstraanist (glükoosi polümeer), agaroosist (punavetikate polüsahariid) või polüakrüülamiidist.
Geelkromatograafia kolonne iseloomustavad mahud: Täidise maht (Vt) Kolonni vaba maht, s.o graanulitevahelise vedeliku maht (Vv) Graanulitesisese vedeliku maht (Vs) Geelmaterjali (maatriksi) maht (Vg) Seega: Vt=Vv+Vs+Vg
Erineva molekulmassiga ainete segu läbijuhtimisel, toimub nende lahutamine üksteisest vastavalt molekulide suurusele. Et segu läbi kolonni transportida ja sisalduvaid aineid üksteisest eraldada, voolutatakse kolonni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust (eluaati) kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- e väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus sisalduva aine elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.
Lühima ajaga väljuvad kolonnist molekulid, mis on liiga suured mahtumaks pooridesse. Nad väljuvad minimaalse elueerimismahuga Vx min, mis on võrdne kolonni graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vx min=Vv.
Kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga Vx max, väljuvad molekulid, mis on küllalt väikesed, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse.
Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku üldmaht ületab kolonni kogumahu: Vx max Vt
Vx max saab ka arvutada, teades geelimaatriksi mahtu: Vx max=Vt ­ Vg
1 Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikumisteguriga:
Töö käik Kõigepealt mõõdeti täidise kõrgus L ja diameeter d, millest lähtudes arvutati täidise kogumaht Vt. Siis arvutati geelimaatriksi maht Vg = k Vt ning Vxmax = Vt ­ Vg. Fraktsioonide üldarvu leidmiseks (kui ühe fraktsiooni maht on 2 ml): n = Vxmax / 2
Vastavalt leitud fraktsioonide arvule võeti kalibreeritud katseklaasid ning nummerdati.
Avati kolonni väljavooluava ning vedelikku koguti väiksesse keeduklaasi, kuni vedeliku tase oli jõudnud täidise pinnani. Kolonni väljavooluava suleti.
0,5 ml automaatpipetiga sisestati kolonni uuritav proov, avati kolonni väljavool ning esialgu väljuvat eluaati koguti väiksesse mõõtsilindrisse. Kui kolonnis liikuv esimene sinine riba oli jõudnud kolonni põhja lähedale, hakati eluaati koguma nummerdatud katseklaasidesse 2 ml kaupa. Fraktsioonide kogumine lõpetati, kui eluaat oli muutunud värvituks.
Ainete kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendati lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse kaudu, mida mõõdeti aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetriga.
Tulemused
Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv:
Uuritava segu koostis: dekstraansinine , müoglobiin, DNP- aspartaat
Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl
2 Mõõtmistulemuste tabel Fraktsiooni number Elueerumismaht V (ml) Optiline tihedus (A) Ühendatud fraktsioon 25 0 1 27 0,042 2 29 0, 2026 3 31 0,1868 4 33 0,0674 5 35 0,0253 6 37 0, 1283 7 39 0,2664 8 41 0,5426 9 43 0,7236 10 45 0,6827 11 47 0,4552 12 49 0,2230 13 51 0,1060 14 53 0,0653 15 55 0,0729 16 57 0,0409 17 59 0,0337 18 61 0,0314 19 63 0,0310 20 65 0 21 67 0 22 69 0 23 71 0 24 73 0,0399 25 75 0,0577 26 77 0,1283 27 79 0,3442 28 81 0,2858 29 83 0,4843 30 85 0,3671 31 87 0,3270 32 89 0,3492 33 91 0,2828 34 93 0,1918 35 95 0,1342 36 97 0, 1223
3 0,8 43 0,7 0,6 83 0,5 0,4 0,3 29 0,2 0,1 0 0 20 40 60 80 100 120
Kromatogramm
Järeldused Uuritava segu komponentidest oli kõige suurema molekulmassiga dekstraansinine, mis väljus minimaalse elueerumismahuga. Väikseima molekulmassiga DNP-aspartaat, mis difundeerus geeli pooridesse ning väljus seetõttu maksimaalse elueerimismahuga.
Vxmin = 29 ml
Vx = 43 ml
Vxmax = 83 ml
Arvutuste teel saadud Vxmax väärtus oli 83,6 ­ langeb põhimõtteliselt kokku katse tulemusel saadud väärtusega. Järelikult töö on õnnestunud.
Segus sisaldunud valgu (müoglobiini) liikuvustegur:
4