Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
KEEMIAINSTITUUT
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL0060 Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö
2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Üliõpilane
Matrikli nr
õpperühm
Juhendaja:
Tallinn 2011
Töö teoreetilised alused:
Geelfiltratsioonikromatograafia ehk geelkromatograafia, mida tuntakse kui kui molekulaarsõelte meetodina, tugines lahuses sisalduvate erinevate molekulmassidega ainete erineval liikuvusel läbi peeneteralise võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Selle meetodi puhul kasutatakse pundunud geeligraanulitega täidetud kolonne. Geeli pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Geelid, mida seda liiki kromatograafias kasutatakse koosnevad dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Mina tegin antud protseduuri kolonnis mis sisaldas geeli Sefadex G-75.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:
Täidise maht Vt
Kolonni vaba maht, st graanulitevahelise vedeliku maht Vv
Graanulitesisese vedeliku maht Vs
Geelimaterjali maht Vg
Vt= Vs+Vg
Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse. Ainet iseloomustab elueerimismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.
Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse siis väljuvad nad kolonnist kõige esimestena ja neil on minimaalne elueerimismaht, mis võrdub kolonni vaba mahuga ja tähistatakse Vxmin
Vxmin=Vv
Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax.
Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületav kolonni kogumahtu.
Seega iseloomustavad mistahes geelkromatograafia kolonni kaks olulist suurust: Vv= Vxmin - vaba maht, mis on eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu.
Vxmax-maksimaalne elueerimismaht, mis on eluaadi maht, mille juures väljuvad need molekulid, mis on võimelised graanilitesse täielikult sisenema.
Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf, mis leitakse valemiga:
Rf= Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin
Töö käik:

Kolonn oli juba täidetud geeliga Sefadex G-75. Avasin väljavoolu, lastes üleliigsel vedelikul kolonnist välja tilkuda.
Oluline oli mitte kolonni lasta kuivaks joosta , sest muidu tungib õhk geelikihti. Kasutatud kolonnil oli automaatselt reguleeritud kiirus.

Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 1ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas.

Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama , puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist : dekstraansinine, müoglobiin, DNP- aspartaat .

Kogusin eelfraktsiooni mõõtkolbi, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogutud eelfraktsiooni mahu mõõtsin mõõtsilindri abil.

Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid.

Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga.
Arvutused:

Geelisamba kõrgus: 17,8cm
Diameeter : 2,4cm, raadius=1,2cm, seega kolonni maht: Vt=3,14x1,22x17,8=80,53 ml
pundumistegur k=0,1
geelimaatriksi maht Vg= 0,1x80,53=8,053 ml
Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax= Vt-Vg=80,53-8,053=72,477 ml
Fraktsioonide(2ml) üldarv n= Vxmax/2 =72,477/2=36,24 ~36
Kokku võtsin 34 fraktsiooni, igaühes 2ml proovi, mõõtekolvis oleva eeljooksu maht: 24 ml, seega teeb kokku 34x2= 68+24=92 ml
Fraktsiooni number
Lainepikkus
Elueerimismaht V, ml
Optiline tihedus, A
Ühendatud fraktsioon
670
24
0
1
670
26
0,035
2
670
28
0,195
3
670
30
0,385
4
670
32
0,116
5
670
34
0,038
6
410
36
0,147
7
410
38
0,465
8
410
40
1,487
9
410
42
2,395
10
410
44
1,762
11
410
46
0,726
12
410
48
0,125
13
410
50
0,082
[---]
21
360
66
0,062
22
360
68
0,085
23
360
70
0,140
24
360
72
0,278
25
360
74
0,569
26
360
76
0,8605
27
360
78
0,951
28
360
80
0,715
29
360
82
0,436
30
360
84
0,244
31
360
86
0,151
32
360
88
0,116
33
360
90
0,1005
34
360
92
0,093
Kromatogramm
Graafikult:
Aine 1=Vxmin=30ml
Aine 2=Vx=42 ml
Aine 3=Vxmax=78 ml
Rf= (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin)= (42-30)/(78-30)=12/48=0,25
Kokkuvõte
Geelkromatograafia on meetod, mis võimaldab lahutada mitmekomponentseid segusid. Geeli poorid on samades mõõtmetes makromolekulidega. Mina kasutasin dekstraani geeli Sefadex G-75, ning kolonni, mis lahutas segusid küllaltki kiiresti ja korralikult.
Erineva molekulmassiga ainete üksteisest eraldamise eesmärgil koguti kolonnist väljuvat lahust kindla mahuga fraktsioonidena, ehk siis 2 ml kaupa ja nendes sisalduva aine kontsentratsiooni määramiseks kasutasin optilise tiheduse määramist
Kolonnis oli näha kolme värvi(sinine, pruun, kollane), see tähendas, et segus oli 3 erinevat ainet ja need lahutusid üksteisest erineva kiirusega. Fraktsioone tuli kokku 35(koos eeljooksuga) ja aega kulus antud töö tegemiseks umbes 3 tundi, koos optiliste tiheduste mõõtmistega. Antud töös nägin, kuidas ainete segu lahutamine sõltub kolonni omadustest, näiteks milline geel seal sees on.
Arvutatud maksimaalne elueerimismaht oli 72,477 ml, katse käigus sain maksimaalseks elueerimismahuks 78 ml. Erinevus tuleneb sellest, et paratamatult on teoorias katsed ja tulemused täpsemad kui praktiliselt neid võimalik saavutada on.
Töö teostatud: