Geelkromatograafia (0)

TTÜ Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL0060
Laboratoorne töö:
nr. 4
Töö pealkiri:
2.2 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Õpperühm:
YAGB22
Töö teostaja :
Õppejõud:
Töö teostatud:
12.04.2010
Protokoll esitatud:
16.05.2010

2.2 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil

Töö teoreetilised alused:
Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia on segu komponentide lahutamise ehk fraktsioneerimise meetod, mis põhineb aine molekulmassidel ja nende erineval jaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel.
Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise , võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse (vastavalt molekuli suurusele).
Geelkromatograafias kasutatavd geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist (margid erinevad üksteisest poorsuse poolest).
Geelkromatograafia kolonne iseloomustavad mahud:
Täidise üldmaht
Vt
Kolonni vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht)
Vv
Graanulitesisese vedeliku maht
Vs
Geelimaterjali (maatriksi) maht
Vg
Vt=Vv+Vs+Vg
Kasutasin kolonni, mis sisaldas Sephadex G-75 geeli.
Uuritava segu läbi kolonni transportimiseks ja erineva molekulmassiga ainete eraldamiseks, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega ( puhver , soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa.
Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest.
Vx – eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.
Vxmin ehk minimaalne elueerimismaht = Vv – kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena.
Vxmax ehk maksimaalne elueerimismaht =≈ Vt - aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt.
Vxmax = Vt – Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin
Töö käik:
Kolonn ja selle ettevalmistamine:

• Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75 k=0,1.
  
• Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 32,2 cm ja diameetri d 1,9 cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = 91,296.
  
• Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 9,1296 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg = 82, 16665.
  
• Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 41,08.
  
• Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks.
  

Segu komponentide lahutamine:

• Segu nr. I: Dekstraansinine , müoglobiin, DNP- aspartaat .
  
• Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 – 1,0 ml/min (eesmärgiks koguda iga fraktsioon ubmes 2-3 minutiga).
  

Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine:

• Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale.
  

• Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 100 ml kuiva kolbi. Mõõtsin selle, sest see moodustab osa dekstraansinise elueerimismahust Vxmin .
  

Ühendatud fraktsiooni maht: 22,5 ml.

• Selleks, et uuritav proov siseneks täidisesse täielikult kandsin geeli pinnale kiiresti peale segu umbes 2 ml voolutuslahust ja kordasin protsessi seni kuni, olin veendunud, et proov on täielikult täidises. Lõpuks kandsin geeli pinnale suurema koguse voolutit.
  
• Kui sinine riba (dekstraansinine) hakkas lähenema kolonni põhjale, eemaldasin ühendatud fraktsiooni kolvi kolonni alt ja alustasin 2 ml mahuga fraktsioonide kogumist katseklaasidesse. Elueerimise ja fraktsioonide kogumise lõpetasin kui eluaat muutus värvituks.
  

Fraktsioonide analüüsimine:

• Mõõtsin kõikide fraktsioonide optilised tihedused , et teada saada ainete kontsentratsioonide mõõdud. Selleks kasutasin spektrofotomeetrit.
  Dekstraansinine: 670 nm
  Müoglobiin: 410 nm
  DNP-aspartaat: 360 nm
  

• Eluaadi maht kolvis oli Vv=22,5 ml. Kuna fraktsioone koguti 2ml kaupa, siis iga järgmise fraktsiooni maht suureneb sellest 2ml võrra.
  

Lainepikkus (nm)
Fraktsiooni nr.
Eluaadi maht (ml)
Optiline tihedus (ABS)
 
670
1
24,5
0,013
 
 
2
26,5
0,184
 
dekstraansinine
3
28,5
0,414
Vxmin
 
4
30,5
0,318
 
 
5
32,5
0,086
 
 
6
34,5
0,023
 
 
7
36,5
0,013
 
 
 
 
 
 
410
9
40,5
0,244
 
 
10
42,5
0,505
 
müoglobiin
11
44,5
0,853
 
 
12
46,5
1,142
 
 
13
48,5
1,212
Vx 
 
14
50,5
1,126
 
 
15
52,5
0,857
 
 
16
54,5
0,575
 
 
17
56,5
0,315
 
 
18
58,5
0,188
 
 
19
60,5
0,101
 
 
20
62,5
0,047
 
 
21
64,5
0,019
 
 
 
 
 
 
360
24
70,5
0,064
 
 
25
72,5
0,177
 
DNP-aspartaat
26
74,5
0,366
 
 
27
76,5
0,613
 
 
28
78,5
0,999
 
 
29
80,5
1,316
 
 
30
82,5
1,444
Vxmax
 
31
84,5
1,319
 
 
32
86,5
1,044
 
 
33
88,5
0,62
 
 
34
90,5
0,322
 
 
35
92,5
0,135
 
 
36
94,5
0,054
 
Kromatogramm:
Tulemused ja nende interpreteerimine:
Arvutan kogu eluaadi mahu: 22,5 + 2*36 = 94,5 ml.
Erinevate värvustega fraktsioonide optilistes tiheduste on nii tõusu kui langust. See näitab ,et aine konsentratsioon kolonnist väljumisel tõuseb, kuni saavutab haripunkti ja langeb ehk lahkub kolonnist.
Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine, see tähendab et tal esines kõige suurem molekulaarmass. Järgmisena lahkus müoglobiin ja viimasena DNP-aspartaat, mis sisenes geeli pooridesse ning seetõttu väljus maksimaalse elueerimismahuga .
1)Eluaadi kogumaht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni
Vxmin= 28,5 ml
2)Eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni
Vx= 48,5 ml
3)Eluaadi kogumaht kuni DNP- aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni
Vxmax= 82,5 ml

Mõõdetud ja arvutusliku Vxmax erinemine:
Mõõdetud Vxmax = 82,5 ml; arvutuslik Vx(max)= 82,16665 ml
Töö õnnestus hästi, sest mõõdetud ja arvutatud Vxmax erinesid väga vähe.
Müoglobiini liikuvusteguri väärtus (segus sisaldunud valk):
Rf = Vx – Vxmin / Vxmax – Vxmin = 48,5 – 28,5 / 82,5 – 28,5 = 20 / 54 ≈ 0,3704