Geelkromatograafia (0)

2. Segude lahutamine ja ainete identifitseerimine

2.1 Kromatograafilised meetodid

KROMATOGRAAFIA - meetod, millega saab ainete segu lahutada komponentideks ning mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel.
Tabel 1. Mobiilne ja statsionaarne faas
MOBIILNE FAAS
STATSIONAARNE FAAS
Agregaatolekust sõltuvalt eristatakse:

• Gaasikromatograafiat
  
• Vedelikkromatograafiat
  
• Ülekriitilise fluidumi kromatograafiat
  

Faasina võib kasutada:

• Adsorbenti
  
• Ioniiti
  
• Biospetsiifilist sorbenti
  
• Poorset geeli
  
• Kandja pooridesse seotud vedelikku
  

Sõltuvalt statsionaarse faasi iseärasustest ja lahutatavate ainete ning faaside vahelistest vastasmõjudest, kasutatakse erinevaid kromatograafia liike:

• jaotuskromatograafia
  
• absorptsioonkromatograafia
  
• afiinsuskromatograafia
  
• ioonvahetuskromatograafia
  
• geelkromatograafia
  

• 
  

Joonis 1. Kromatograafia liike illustreerivad skeemid
Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse aminohapete, valkude, süsivesikute, lipiidide jt biomolekulide segude lahutamisel. Kromatograafilist protsessi võib läbi viia nii kinnises süsteemis – kolonnis (kolonnkromatograafia) – kui ka lahtises süsteemis: paberil või kromatograafilisel plaadil (planaarkromatograafia).
KOLONNKROMATOGRAAFIA:
Kolonnkromatograafia võimaldab lahutada suuremaid ainehulki kui planaarkromatograafia. Tahke materjaliga , millele saab kanda statsionaarset faasi, pakitud kolonni sisestatakse uuritav proov , mille komponente soovitakse üksteisest lahutada. Kolonni voolutatakse lahustite segu – vooluti e. eluendiga. Kui proovis sisalduvate ühendite lahustuvused mobiilses ja statsionaarses faasis on erinevad, siis liiguvad nad kolonnis erinevate kiirustega ja väljuvad kolonnist erinevatel aegadel . Kogudes väljuvat vedelikku e. eluaati kogu selle protsessi vältel üksikute fraktsioonidena ongi võimalik segu komponendid üksteisest lahutada. Joonis 2. Kolonnkromatograafia

2.1.1 Geelkromatograafia

Antud töös on ainete segu lahutamiseks kasutusel geelkromatograafia e. geelfiltratsioon-kromatograafia.
Selle kromatograafia meetodi põhimõte:
lahuses sisalduvate ainete lahutamine molekulmassi suuruse järgi (tuntud ka kui molekulaarsõelte meetod ja eksklusioonkromatograafia).
Lahuses sisalduvad ained liiguvad tänu erinevale molekulmassile läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega.
Joonis 3. Segu geelkromatograafilise lahutamise põhimõte
Geelkromatograafiat kasutatakse:

• makromolekulide lahutamiseks
  
• lisandite eemaldamiseks
  
• puhvri vahetamiseks
  
• soolade eraldamiseks
  

Uuritav proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. See protsess viiakse läbi kolonnis, mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus uuritavas lahuses sisalduvate makromolekulide mõõtmetega.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:

• kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht (Vv)
  
• graanulitesisese vedeliku maht (Vs) Vt = Vv + Vs + Vg
  
• geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg)
  
• täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt)
  

Joonis 4. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad mahud
Kui läbi geelkromatograafia kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu, siis molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurusele ehk vastavalt molekulide võimele difundeeruda geeli pooridesse:

kolonni viiakse uuritava aine

lisatakse sobiv vesilahus ( puhver , soolalahus vm)

fraktsioonidena kogutud eluaadis sisalduvad ainete kontsentratsioonid tehakse kindlaks erinevate füüsikalise ja keemilise analüüsi meetodeid kasutades
ELUEERIMIS- ehk VÄLJUMISMAHT (Vx):

• iseloomustab iga ainet, mis sisaldub segus
  
• selle suuruse arvväärtus sõltub aine molekulmassist ning kasutatava kolonni tüübist
  
• erinevate molekulmassidega ainete väljumismahte tähistatakse: Vx1, Vx2, Vx3 ...
  
• selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljuvas fraktsioonis on vastava aine kontsentratsioon maksimaalne
  

MINIMAALNE ELUEERIMISMAHT (Vxmin ):

• kui segus on molekule, mis on liiga suured, et mahtuda kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena ehk kõige kiiremini
  
• võrdne graanulitevahelise vedeliku mahuga
  

Vxmin = Vv
MAKSIMAALNE ELUEERIMISMAHT (Vxmax):

• Ained, mille molekulmass on väiksem, difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ning liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt
  
• on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt.
  

Kromatografeerimise protsess on lõpetatud, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi) üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga.
Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis võib maksimaalse elueerimismahu
ka arvutada
Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja kaht parameetrit:

• kolonni vaba mahtu Vv ), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu
  
• maksimaalset elueerimismahtu , s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad
  

LIIKUVUSTEGUR (Rf): ---> Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0...1 (0