Geelkromotograafia (0)

YKL0060 Biokeemia- praktikum
Laboratoorne
töö nr. 2.1
Töö pealkiri:
Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil

Õpperühm:
KATB-41
Töö teostaja:
Sigrid Reinsalu
095908
Õppejõud:
Tiina Randla
Töö teostatud:
28.02.2011
Protokoll esitatud:
Protokoll arvestatud:
Töö teoreetilised alused
Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel. Geelkromatograafia meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate ainete molekulmasside erinevusele.Geelkromotograafias viiakse protsess läbi kinnises süsteemis-kolonnis, mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurjusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensiooniga. Geelkromotograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist,agaroosist või polüakrüülamiididst. Kolonni lastakse mingi segu(minu segu koosnes: dekstraansinisest,müoglobiinist, DNP-aspartaadist). Kolonni alumisse ossa pannakse klaasvill(takistus).Kogu töö põhimõte on selles, et kolonnist väljuvad ained oma molekulmasside järgi, see tähendab, et molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse, tulevad kolonnist läbi esimesena. Kõige väiksemad molekulid aga takistuvad pooridesse, ning väljuvad geelist viimastena.Katse käigus pidi lisama kolonni pidevalt elueerimisvedelikku ( kasutasin selleks :7,5 PH; Tris/HCl 0,1 M NaCl), et geel ära ei kuivaks ning, et katse õnnestus, see vedelik ise katse tulemust ei mõjutanud. Läbi tulnud vedelik kogutakse 2ml fraktsioonidena katseklaasidesse, et neid saaks spektromeetriliselt analüüsida. Vastavalt fraktsiooni värvile mõõdetakse tema optiline tihedus kindlal lainepikkusel. Optiline tihedus määrab aine kontsentratsiooni.
Väljunud vedelik kogutakse 2ml fraktsioonidena katseklaasidesse, et neid saaks spektromeetriliselt mõõta. Vastavalt fraktsiooni värvile mõõdetakse tema optiline tihedus kindlal lainepikkusel. Optiline tihedus määrab aine kontsentratsiooni.
Töö käik
Ettevalmistus

• Kolonni üleosa suletakse korgiga , mida läbib klaastoru.
  
• Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku.
  
• Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama.
  

Lahuse sisestamine kolonni

• lahuse kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast.
  

Elueermine

• Varutakse väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogutakse kolonni täidise
  

pinnal olev eluent , mis enne uuritava segu sisestamist tuleb kolonnist välja lasta.

• Kui esimene vedelik hakkab jõudama kolonni põhjani, siis eemaldakse kolb ja hakatakse koguma fraktsioonen 2ml kaupa erinevatsesse katseklaasidesse
  
• Siis mõõdetakse kõigi fraktsioonide optilised tihedused spektromeetriga.
  

Arvutused
Kõige esimesena mõõdetakse:

kolonni pikkus l= 22,6 cm,

kolonni diameeter d= 2,4 cm.

Seejärel arvutatakse kolonni kogumaht Vt= πr2h= 3,14*(2,4/2)*22,6=85,15 cm3

k=0,1

Seejärel arvutatakse geelmaatrikis maht Vg=k*Vt = 85,15*0,1=8,51cm3

Vg lähtuvalt arvutatakse max elueerimismaht Vx max=Vt-Vg=85,15-8,51=76,64 cm3

Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml,
seega n= Vx max /2= 76 /2=38
Esimese elueerimismaht oli 15 ml
Optilise tiheduse table
Dekstraansinine
670nm
Müoglobiin
410 nm
DNP- aspartaat
360nm
0,011
0,129
0,166
0,335
0,612
0,542
0,484
1,683
1,555
0,329
1,999
2,636
0,154
1,171
3,179
0,358
2,366
Vahepeal 13 värvitut
1,301
0,468
0,150
0,082
0,056
0,052
0,029
Fraktsioonide analüüs
Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk
optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval
lainepikkusel. Lainepikkused, millel mõõtmine läbi viiakse, sõltuvad uuritavate ainesegude
koostisest ja need soovitab praktikumi juhendaja . Absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetritel.
Koostage kromatogramm, mille y- teljel on optiline tihedus ja x+teljel eluaadi maht, märkides ära Vminx, Vx ja Vmaxx asukohad.
Dekstraansinine müoglobiin DNP-aspartaat
Vxmin =21 ml Vx= 33 ml Vxmax= 73ml
Vx - Vxmin 33-21
Rf = –––––––––––– = –––––––– = 0,230
Vxmax - Vxmin 73-21
Järeldused
Katse õnnetus enam-vähem. Erinevus teoreetilise ja saadud Vxmax-i vahel võis olla tingitud kolonni mahu määramises (kõrgus ja sisediameetri mõõtmisel)