Geelkromatograafia (2)

TTÜ keemiainstituut
Biokeemia õppetool
YKL3312 Biokeemia-praktikum
Laboratoorne
töö nr. 2.2
Töö pealkiri:
Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Õpperühm:
YASB-21
Töö teostaja :
Andrei Popov
082559
Õppejõud:
Tiina Randla
Töö teostatud:
Protokoll esitatud:
Protokoll arvestatud:

Teoreetiline osa.

Geelkromatograafia on meetod erinevate suurustega molekulide eraldamiseks segust . Kolonni laetakse peeneteraline, võimalikult ühtlase poorsusega geel , kolonni alumisse otsa pannakse geeli mitte läbilaskev, kuid uuritavate ainete läbimist lubav takistus(klaasvill), mis lubab eraldada puhastatava aine geelist endast.
Molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse, tulevad kolonnist läbi esimesena. Kõige väiksemad molekulid aga takistuvad pooridesse, ning väljuvad geelist viimastena. Et geel ära ei kuivaks, ning et ta maksimaalselt lahutaks, tuleb pärast proovi kolonni sisestamist pidevalt lisada elueerimisvedelikku, mis ise ei muuda katse tulemusi.
Läbi tulnud vedelik kogutakse 2ml fraktsioonidena katseklaasidesse, et neid saaks spektromeetriliselt analüüsida. Vastavalt fraktsiooni värvile mõõdetakse tema optiline tihedus kindlal lainepikkusel. Optiline tihedus määrab aine kontsentratsiooni.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:
Vt – täidise maht
Vv – kolonni vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht)
Vs – graanulitesisese vedeliku maht
Vg – geelimaatriksi maht
Vt=Vv+Vs+Vg
Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.
Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht Vxmin , mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv
Ained, mille molekulid on piisavalt väiksed, et mahtuda täielikult geeli pooridesse väljumad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on ligilähedane kolonni kogumahule Vxmax ≈Vt . Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedelikku maht ületab kolonni kogumahtu.

Töö käik.

Kolonni tätmine ja iseloomustamine

Geel: Sefadex 6-50
Täidetud kolonnile arvutatakse geelisamba kõrguse ja diameetri alusel täidise kogumaht Vt
Geelisamba kõrgus = 31cm
Sissediameeter = 2,0 cm
Vt = πr2h = 3,14*12*31= 97,34 cm3
Vastavalt kolonni täitematerjalli iseloomustava teguri k väärtusele leitakse geelimatriksi maht Vg
k = 0.1
Vg = k*Vt = 0,1* 97,37 = 9,734 cm3
Geelimatriksi mahust lähtuvalt leiame antud kolonnile iseloomulik maksimaalne elueerimismaht Vxmax
Vxmax =Vt-Vg = 97.37 – 9,734 = 87,6= 88 cm3
Kui fraktsioonide mahuks võtta 2 ml, siis peaks kokku saama 88/2=44 fraktsiooni.

Kromatografeerimissüsteemi koostamine

Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku.
Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama.

Proovide ettevalmistamine ja sisestamine

Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine , müoglobiin ja DNP- aspartaat , millest kõik ained on värvilised.
Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast.

Kolonni elueerimine

Enne voolustamise alustamist asetakse 100ml kuiv kooniline kolb väljalaskeava alla ja avatakse väljavool kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan.
Kui esimene värviline riba läheneb kolonni põhjale, eemaldatakse kooniline kolb ja edaspidi kogutakse kolonnist väljuvat vedelikku fraktsioonidena kaalibritud katseklaasidesse. Koonilises kolvis oli 30ml.
Kogutavate fraktsioonide arv = 46
Mõõdetakse kõigi fraktsioonide optilised tihedused , reguleerides spektrofotomeetri vastavale lainepikkusele.
Dekstraansinine
670nm
Müoglobiin
410 nm
DNP-aspartaat
360nm
0,015
0,621
0,041
0,131
0,814
0,067
0,323
0,916
0,099
0,263
0,896
0,168
0,091
0,869
0,264
0,799
0,376
0,612
0,526
0,508
0,642
0,452
0,736
0,336
0,803
0,253
0,827
0,203
0,785
0,172
0,738
4 tükki jäi vahele
0,653
0,551
0,454
0,363
0,270
0,220
0,164
3 tükki jäi vahele

Fraktsioonide analüüsimine

Koostage kromatogramm, mille y- teljel on optiline tihedus ja x+teljel eluaadi maht, märkides ära Vminx, Vx ja Vmaxx asukohad.
Vmin=36ml Vx= 48 ml Vmax = 98ml
Dekstraansinine Müoglobiin DNP-aspartaat
Vx - Vxmin 48 - 36
Rf = –––––––––––– = –––––––– = 0,21
Vxmax - Vxmin 98 – 36
Järeldus: Segus sisaldunud komponendid väljusid sellises järjekorras, nende molekulmassi tõttu.
Kõige madalama molekulmassiga dekstraansinine väljus esimesena, sest tema osakesed olid liiga suured geeli pooride mahutamiseks Teisena väljus müoglobiin ja kolmandana kõige kõrgema kontsentratsiooniga DNP-aspartaat. Saadud Vmax on suurem kui teoreetiline ebatäpsuse tõttu.