Geelkromatograafia (5)

Tallinna Tehnikaülikool
Biokeemia - parktikum
YKB3312
Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Üliõpilane: Liisa Kivi
Juhendaja : Tiina Randla
KROMATOGRAAFIA - segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse laialdaselt amiohapete, valkude, süsivesikute jt ainete segude lahutamisel.
GEELKROMATOGRAAFIA meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate erineva molekulmassiga ainete erineval liikuvusel läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Antud meetodi puhul kasutasin pundunud geeligraanulitega täidetud kolonni. Geeli pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Geeli poori suurust ületavate mõõtmetega molekulide tungimine terakestesse on välistatud.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustasid järgmised mahud:

• Täidise maht (Vt)
  
• Kolonni vaba maht (Vv)
  
• Graanulitesisese vedeliku maht (Vs)
  
• Geelimaterjali maht (Vg)
  

Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse (vastavalt molekuli suurusele). Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht Vx (eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.)
Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena. Neil on minimaalne elueerimismaht ( Vxmin = kolonni vaba maht).
Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeerude täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga (Vxmax = Vt-Vg).
Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf:
Fraktsioonide arvutamine:
r = 2,2/2=1,1 cm
h = 31,5 cm
Geeli maht:
Vt = Sp*h = πr2*h = π*(1,1)2*31,5 =119,68 cm3
k = 0,1
Vg = k*Vt = 0,1*119,68 = 11,9 cm3
Vxmax = Vt – Vg = 119,68 – 11,9 = 107,7 cm3
Fraktsioonide teoreetiline arv: n = Vxmax/2 =107,7/2 = 53
Kogusin kolonni väljavooluavast tilkuva eluaadi koonilisse kolvi ning hiljem mõõtsin ära vedeliku mahu:
Vv = 34 ml
Uuritav segu koosneb kolmest komponendist : dekstraansinine , müoglobiin ja DNA- aspartaat , elueerimispuhvriks oli pH=7,5 0,05M Tris/HCl.
Kolonn sisaldab: Sefadex G-50
Lainepikkus (nm)
Fraktsiooni nr
Eluaadi maht (ml)
Optiline tihedus
 
1
36
0,037
 
2
38
0,169
670
3
40
0,248
 
4
42
0,189
 
5
44
0,095
6
46
0,039
 
6
46
0,692
 
7
48
0,849
 
8
50
0,933
 
9
52
0,931
 
10
54
0,866
410
11
56
0,766
 
12
58
0,642
 
 
25
84
0,164
 
26
86
0,257
 
27
88
0,362
 
28
90
0,478
 
29
92
0,604
360
30
94
0,696
 
31
96
0,722
 
32
98
0,702
 
33
100
0,654
34
102
0,582
35
104
0,480
36
106
0,384
37
108
0,223
 
38
110
0,185
Vxmin on eluaadi maht, kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Vx on eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni ja Vxmax on eluaadi kogumaht kuni DNA- aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Leian müoglobiinile liikuvusteguri Rf . Täpsuse mõttes võtan andmed tabelist.
=0,178
JÄRELDUS.
Töö õnnestus enam vähem hästi, ainete piir oli üpriski eristatav .
Käesolevas lahuses olevad komponendid eraldusid antud järjekorras kuna nende ainete molekulmassid liiguvad kolonni erineva kiirusega. See on tingitud ainete molekulide erinevast jaotumisest geeli pooridesse ja molekulide suurusest . Esimesena väljus kõrgmolekulaarne dekstraansinine, peale seda müoglobiin ja seejärel väikse Mr-ga DNP-aspartaat. Sahharoos oleks tõenäoliselt väljunud umbes ühel ajal DNP-aspartaadiga kuna mõlemad on madalmolekulaarsed.
Erinevus teoreetilise ja saadud Vxmax-i vahel võis olla tingitud kolonni mahu määramiseks mõõdetud kõrguse ja diameetri leidmisel tehtud veast. Suurema diameetri ja kõrguse korral oleks teoreetiline Vxmax tulnud ligilähedane saadud tulemusega.