Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

Laboratoorne töö 2.1
Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Töö teostaja
Õpperühm
YASB21
Üliõpilaskood
Töö teostamise kuupäev
20.02.13
Juhendaja
Tiina Randla
Protokolli esitamise kuupäev
12.03.13
Teooria
Geelkromatograafia on segude lahutamise meetod, mis põhineb lahuses esinevate ainete eri suurusega molekulmasside liikumiskiirusel. Ained liiguvad läbi peeneteralise geeli erineva kiirusega: suure molekulmassiga osakesed liiguvad kiiremini kui väikese molekulmassiga.
Protsess viiakse läbi kolonnis , kus on pundunud geel ja mille poorid on samas suuruses lahuse makromolekulide dimensioonidega. Geelkromatograafias kasutusel olevad geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist.
Selleks, et uuritav proov saaks läbi kolonni liikuda , voolutatakse kolonni pidevalt vesilahusega ning kogutakse väljuv fraktsioon kindla mahu kaupa. Kogutud fraktsioonide kindlakstegemiseks kasutatakse füüsikalisi ja keemilisi analüüsi meetodeid.
Igal ainel, mis uuritavas proovis sisaldub, on elueerimismaht , mis sõltub aine molekulmassist ja kolonni parameetritest. Elueerimismaht on selline eluaadi maht, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige suurem.
Kõige esimesena väljuvad kolonnist need molekulid, mis on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse. Nende molekulide elueerimismaht on minimaalne ja võrdub kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga.
Kõige viimasena väljuvad kolonnist need molekulid, mille molekulmass on väike ja mis mahuvad geeli pooridesse. Nende molekulide elueerimismaht on maksimaalne ja lähedane kasutatava kolonni kogumahule.
Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui väljunud fraktsioonide maht võrdub kolonni kogumahuga.
Kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte parameetrit: kolonni vaba mahtu (eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis geeli pooridesse ei mahu) ja maksimaalset elueerimismahtu ( eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid mis geeli pooridesse täielikult sisenevad).
Kromatogrammiks nimetatakse eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja mahu vahelist graafikut.
Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja fraktsioonikogurist. Tihti on kasutusel automaatkolonnid, mis automaatselt lisavad kolonni eluenti, antud töös on aga kasutusel klaaskolonnid, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex G - 75. Kolonn on kinnitatud statiivile sellisele kõrgusele, et alla mahuks katseklaas . Käsitsi tuleb lisada nii eluenti kui ka fraktsioone koguda.
Ainete kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit.
Töö käik
Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine

• Kolonn asetataksse statiivile vertikaalselt
  
• Kolonni täidise mark ja seda iseloomustav tegur k märgitakse üles.
  
• Mõõdetakse geeli kõrgus L ja diameeter d.
  
• Arvutatakse geeli kogumaht Vt.
  
• Arvutatakse geelmaatriksi maht Vg ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax.
  
• Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, võttes ühe fraktsiooni mahuks 2 ml.
  
• Katseklaasistatiivi asetatakse arvule n vastav katseklaaside hulk, nummerdatakse.
  
• Valmistatakse ette voolutuslahus ja leitakse sobiv pipett lahuse kolonni viimiseks .
  
• Varutakse väike keeduklaas , kuhu kogutakse geeli pinnal olev eluent .
  

Segu komponentide lahutamine

• Avatakse kolonni väljavooluava ning kogutakse täidise kohal olev eluent keeduklaasi.
  
• Reguleeritakse kolonni voolukiirus sobivaks: 0,7 – 1,0 ml/min.
  
• Vedeliku tase lastakse joosta geeli pinnani ning suletakse väljavooluava.
  

Proovi sisestamine

• Pipeti abil viiakse 0,5 ml proovi kolonni.
  
• Proov lastakse voolata ühtlaselt geeli pinnale.
  

Kolonni voolutamine

• Kolonni väljavool avatakse ja eluaati kogutakse esialgu kolbi, sest alguses väljub kolonnist puhas vooluti.
  
• Kui proov on geeli sisenenud viiakse pipeti abil kiiresti väike kogus voolutit ja lastakse imbuda. Korratakse veel kord sama.
  
• Kui proov on täielikult geeli imbunud kantakse geeli pinnale suurem hulk voolutit.
  
• Kui esimene värviline riba on kolonnis lähenemas põhjale, eemaldatakse kolb ning hakatakse eluaadti koguma 2 ml mahu kaupa katseklaasidesse.
  
• Kogu voolutamise vältel jälgitakse, et geeli kohal oleks piisavalt eluenti ja seda lisatakse vajadusel pidevalt juurde.
  
• Elueerimise võib lõpetada, kui eluaat muutub värvituks ja eluaadi summaarne maht ei ole väiksem kui kolonni kogumaht. Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule.
  

Fraktsioonide analüüsimine

• Aine kontsentratsiooni väljendatakse optilise tiheduse väärtusena, mis mõõdetakse vastaval lainepikkusel spektrofotomeetris.
  
• Spektrofotomeetris mõõdetakse segude optilist tihedust järgmistel lainepikkustel: sinised segud 670 nm, kollased segud 410 nm ja pruunikad segud 370 nm.
  
• Täiesti värvusetute fraktsioonide optilised tihedused võrduvad 0-ga ja neid pole vaja mõõta.
  
• Saadud tulemustest koostatakse katseandmete tabel ja selle alusel kromatogramm.
  

Kolonni iseloomustavad parameetrid

• Geel: Sephadex G – 75 , fraktsioneermispiirkond 3000 – 80000 Daltonit
  
• Geeli pundumistegur: k = 0,1
  
• Täidise kõrgus L = 31.5 cm
  
• Kolonni sisediameeter: d = 2,1 cm
  

Proovi komponendid

• Dekstraalsinine (6mg/ml)
  
• Müoglobiin (6mg/ml)
  
• DNP – aspartaat (0,6 mg/ml)
  

Mõõtmis- ja arvutamistulemused

Kolonni täidise maht Vt

Geelmaatriksi maht Vg

Kolonni maksimaalne elueerimismaht Vx,max

Fraktsioonide üldarv n.

Mõõtmistulemuste tabel
Fraktsiooni number
Elueerimismaht V, ml
Optiline tihedus, A
Ühendatud fraktsioon
25
0
1
27
0,0177
2
29
0,344
3
31
0,0983
4
33
0,1183
5
35
0,02786
6
37
0,8619
7
39
1,3882
8
41
1,2529
9
43
0,8097
10
45
0,4156
11
47
0, 1779
12
49
0,0718
13
51
0,0262
14
53
0,0118
15
55
0,046
16
57
0
17
59
0
18
61
0
19
63
0
20
65
0
21
67
0
22
69
0
23
71
0,2542
24
73
0,1119
25
75
0,3433
26
77
0,8395
27
79
1,5273
28
81
1,6541
29
83
2,311
30
85
1,9336
31
87
1,2758
32
89
0,5664
33
91
0,1829

Kromatogramm

Kromatogrammi analüüs

• Eluaadi maht kuni kõrgema kontsetratsiooniga dekstraalsinise fraktsiooni väljumiseni:
  

Vxmin = 29 ml

• Eluaadi maht kuni kõrgaima kontsentratsiooniga müoglobiini väljumiseni:
  

Vx = 39 ml

• Eluaadi maht kuni kõrgema kontsentratsiooniga DNP- aspartaadi väljumiseni:
  

Vxmax = 85 ml

• Liikuvustegur Rf valk müoglobiini jaoks:
  

Järeldused

• Esimesena väljus kolonnist dekstraalsinine. Selle aine osakesed on liiga suured et mahtuda selle geeli pooridesse. Dekstraalsinine on proovi kõige suurema molekulmassiga aine, seetõttu väljus dekstraalsinine kolonnist kõige kiiremini.
  
• Teisena väljus kolonnist müoglobiin, mis osaliselt difundeerus geeli pooridesse. Müoglobiini molekulmass on väiksem kui dekstraalsinisel, kuid suurem kui DNP-aspartaadil.
  
• Viimasena väljus DNP-aspartaat ning selle aine osakesed geeli pooridesse ei mahtunud. Selle aine molekulid on kõige väiksemad ja ka kõige väiksema molekulmassiga, mistõttu väljus see aine kolonnist viimasena.
  
• Eelpool arvutatud Vx,max väärtust erineb katselise Vxmax väärtusest: 98 – 85 = 13 ml.
  

Arvutuslikult oleks pidanud eluaati koguma 13 ml rohkem. Erinevus võib põhineda valedel kolonni mõõtmistulemustel. Võisin eksida kolinni läbimõõdu ja kõrguse mõõtmisel. Samuti võisin fraktsioone koguda ebatäpselt: 2 ml asemel võis ühte katseklaasi sattuda natuke rohkem või vähem eluaati.