Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

Laboratoorne töö II
Üliõpilane: Meelika Lukner (155308)
Kuupäev: 26.02. 2016
Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Geelkromatograafia ehk molekulaarsõelte meetod ehk ekslusioonkromatograafia on meetod lahuses olevate ainete lahutamiseks nende molekulmassi suuruse järgi. Ained (milleks on makromolekulid, lisandid või soolad ) liiguvad läbi poorse geeli erineva kiirusega, kusjuures proov liigub läbi kolonni vesilahuse abil. Protsess viiakse läbi kolonnis , mille sees on pundunud geeligraanulid, mis koosnevad dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist.
[ http://image.slidesharecdn.com/chrom-lect6-141121074837-conversion-gate01/95/chromatographic-methods-of-analysis-gel-chromatography-method-4-638.jpg?cb=1416556188 ]
Geelkromatograafia kolonni iseloomustab täidise kogumaht
Vt = Vv + Vs + Vg,
kus Vv on graanutlitevahelise vedeliku maht, Vs graanulitesisese vedeliku maht ja Vg geelimaterjali ehk -maatriksi maht.
Selleks, et uuritavaid aineid saaks läbi kolonni transportides üksteisest eraldada, tuleb kasutada sobivat voolutit ehk eluenti. Eluenti kogutakse aga kindla mahuga fraktsioonide kaupa (antud töös 2 ml).
Elueerimismaht Vx on eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Liiga suured molekulid ei mahu graanulitesse ja väljuvad kolonnist esimesena, st nad on minimaalse elueerimismahuga ja on võrdsed graanulitevahelise vedeliku mahuga.
Vxmin = Vv
Väiksed molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemini. Nad on maksimaalse elueerimismahuga on arvväärtuselt lähedased kolonni kogumahule.
Vxmax = Vt
Seda saab arvutada ka geelimaatriksi mahu abil
Vxmax = Vt - Vg
Aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja mille elueerimismaht on antud kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf.
Rf = (Vx – Vxmin)/(Vxmax – Vxmin) , kus 0 Fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammi. Käesolevas töös kasutatakse konstentratsioonide kindlakstegemisel spektrofotomeetrilist meetodit.
Töö käik
Antud töös kasutan Sephadex G-75 geeli, mille k=0,1.
Mõõdan geelisamba kõrguse L=15,5 cm ja sisediameetri d=2,7 cm. Siit saan arvutada geelitäidise kogumahu Vt.
Vt = Sp × L = π × ( )2 × L
Vt = π × ( )2 × 15,5 cm = 88,7 cm3
Siit saan arvutada geelimaatriksi mahu Vg.
Vg = k × Vt
Vg = 0,1 × 88,7 cm3 = 8,87 cm3 = 8,9 cm3
Ning kolonni maksimaalse elueerimismahu Vxmax
Vxmax = Vt - Vg
Vxmax = 88,7 cm3 – 8,9 cm3 = 79,8 cm3
Siit arvutan fraktsioonide üldarvu, kus ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml
n =
n = = 39,9 = 40
Seejärel lasen eluenti (0,15 M NaCl lahus) kolonnist keeduklaasi, kuni eluendi tase kolonnis langeb täidise piirini . Pean silmas, et vedelikunivoo alla täidise piiri ei langeks, muidu satub geelikihti õhk, mis võib katsetulemusi mõjutada. Hoides kolonni väljavooluava suletuna, pipeteerin 0,5 ml uuritavat ainet ühtlaselt geeli pinnale ning lasen sellel valguda läbi geeli. Uuritav lahus sisaldab dekstraansinist, müoglobiini ja DNP-aspartaati (vedelik on algul rohelist värvi).
Seni, kuni dekstraansinine (mis on kõige kiiremini liikuv aine) jõuab kolonni alaossa, kogun vooluti (seda pidevalt lisades) ühendatud fraktsioonina keeduklaasi. Mõõdan selle koguse sobiva mõõtsilindriga ära ning saan tulemuseks Vüf=20,65 ml.
Kui sinise värvusega dekstraansinine on jõudnud kolonni alaossa, võtan ühendatud fraktsioonina kogutud keeduklaasi alt ning hakkan fraktsioone 2 ml kaupa katseklaasidesse koguma. Seda teen seni, kuni kolonnis ei esine enam ühtegi värvust ning eluaadi värvus on muutunud värvituks. Kogusin kokku 33 katseklaasi (ehk 66 ml) fraktsioone. Kokku Vkokku=86,65 ml (koos ühendatud fraktsiooniga).
Seejärel mõõdan katseklaasides olevate lahuse optilised tihedused , määramaks nende kontsentratsiooni. Selleks kasutan spektrofotomeetrilist meetodit.
Fraktsiooni nr
Elueerimismaht V, ml
Optiline tihedus, A
Ühendatud fraktsioon
20,65
0, 1563
1.
22,65
0,2076
2.
24,65
0,4415
3.
26,65
0,2955
4.
28,65
0,012
5.
30,65
0,001
6.
32,65
0,0001
7.
34,65
0,1184
8.
36,65
0,2055
9.
38,65
0,4637
10.
40,65
0,8267
11.
42,65
1,2638
12.
44,65
1,5513
13.
46,65
1,5043
14.
48,65
0, 1902
15.
50,65
0,0238
16.
52,65
0,0237
17.
54,65
0,0552
18.
56,65
0,0564
19.
58,65
0,0329
20.
60,65
0,0128
21.
62,65
0,0137
22.
64,65
0,0224
23.
66,65
0,2187
24.
68,65
0,6972
25.
70,65
1,7187
26.
72,65
1,2094
27.
74,65
0,9608
28.
76,65
0,9561
29.
78,65
0,7461
30.
80,65
0,5105
31.
82,65
0,3212
32.
84,65
0,1836
33.
86,65
0,0924
Esimesena väljus dekstraansinine, mille kontsentratsioon on üsna väikene. Kuna see väljus esimesena, siis on ka tegu kõige suurema molekulmassiga ainega.
Teisena väljus müoglobiin, mille kontsentratsioon on juba ligikaudu 10 korda suurem. See väljus kolonnist teisena, mis tähendab, et selle molekulmass on väiksem dekstraansinisest, aga suurem DNP-aspartaadist.
Viimasena väljus DNP- aspartaat , mille kontsentratsioon on enam-vähem sarnane müoglobiinile. Viimasena väljununa on selle aine molekulmass kõige väiksem.
Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsioonini (kaasa arvatud on) Vxmin = Vv = 24,65 ml
Eluaadi maht kuni valgu kõige kõrgema kontsentratsiooniga (kaasa arvatud) väljumiseni Vx=44,65 ml
Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud kõrgeima kontsentratsiooniga (kaasa arvatud) fraktsiooni väljumiseni Vxmax= 70,65 ml
Arvutuslik Vxmax ei erine väga oluliselt tegelikust mahust. Vahe võis sisse tulla ebatäpsest kolonni mõõtmisest, mis mõjutab arvutusi.
Arvutan nende andmete põhjal Rf väärtuse, kasutades arvutuslikku Vxmax väärtust. Rf on liikuvustegur, mis iseloomustab aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse. Arvväärtus peaks jääma vahemiku 0....1.
Rf = = = 0,36