Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

TTÜ
Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Töö nr
2.1
Töö pealkiri
AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL
Üliõpilane
Õpperühm
KATB41
Töö teostatud
19/03/2012
Arvestatud
TEOORIA
KROMATOGRAAFIA - segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse laialdaselt amiohapete, valkude, süsivesikute jt ainete segude lahutamisel.
GEELKROMATOGRAAFIA meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate erineva molekulmassiga ainete erineval liikuvusel läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Antud meetodi puhul kasutasin pundunud geeligraanulitega täidetud kolonni. Geeli pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Geeli poori suurust ületavate mõõtmetega molekulide tungimine terakestesse on välistatud.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustasid järgmised mahud:

• Täidise maht (Vt)
  
• Kolonni vaba maht (Vv)
  
• Graanulitesisese vedeliku maht (Vs)
  
• Geelimaterjali maht (Vg)
  

Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse (vastavalt molekuli suurusele). Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht Vx (eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.)
Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena. Neil on minimaalne elueerimismaht ( Vxmin = kolonni vaba maht).
Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeerude täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga (Vxmax = Vt-Vg).
Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf:
TÖÖ KÄIK, ARVUTUSED, TABELID , GRAAFIKUD
Fraktsioonide arvutamine:
r = 2,3/2=1,15 cm
h = 29,5 cm
Geeli maht:
Vt = Sp*h = πr2*h = π*(1,15)2*29,5 =122,56 cm3
k = 0,1
Vg = k*Vt = 0,1*122,56 = 12,256 cm3
Vxmax = Vt – Vg = 122,56 – 12,256 = 110,30 cm3
Fraktsioonide teoreetiline arv: n = Vxmax/2 =110,3/2 = 55,15
Kogusin kolonni väljavooluavast tilkuva eluaadi koonilisse kolvi ning hiljem mõõtsin ära vedeliku mahu:
Vv = 27 ml
Uuritav segu koosneb kolmest komponendist : dekstraansinine 3mg/ml, müoglobiin 6mg/ml ja DNA- aspartaat 0,3mg/ml, elueerimispuhvriks oli pH=7,4 20mM Tris 0,15M NaCl
Kolonn sisaldab: Sephadex G-75
Lainepikkus (nm)
Fraktsiooni nr
Eluaadi maht (ml)
Optiline tihedus
 
 
670
 
 
1
36
0,007
2
38
0,067
3
40
0,160
4
42
0,248
5
44
0,180
 
 
 
 
 
410
 
 
6
46
0,039
6
46
0,113
7
48
0,340
8
50
0,630
9
52
0,944
10
54
0,782
11
56
0,552
12
58
0,326
 
 
 
 
 
360
 
 
 
 
27
84
0,032
28
86
0,057
29
88
0,123
30
90
0,239
31
92
0,375
32
94
0,465
33
96
0,513
34
98
0,485
35
100
0,403
36
102
0,293
37
104
0,195
38
106
0,116
39
108
0,066
40
110
0,040
Vxmin on eluaadi maht, kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Vx on eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni ja Vxmax on eluaadi kogumaht kuni DNA- aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Leian müoglobiinile liikuvusteguri Rf . Täpsuse mõttes võtan andmed tabelist.
=0,185
JÄRELDUS.
Töö õnnestus enam vähem hästi, ainete piir oli üpriski eristatav.
Käesolevas lahuses olevad komponendid eraldusid antud järjekorras kuna nende ainete molekulmassid liiguvad läbi kolonni erineva kiirusega. See on tingitud ainete molekulide erinevast jaotumisest geeli pooridesse ja molekulide suurusest . Esimesena väljus kõrgmolekulaarne dekstraansinine, peale seda müoglobiin ja seejärel väikse Mr-ga DNP-aspartaat. Sahharoos oleks tõenäoliselt väljunud umbes ühel ajal DNP-aspartaadiga kuna mõlemad on madalmolekulaarsed.
Erinevus teoreetilise ja saadud Vxmax-i vahel võis olla tingitud kolonni mahu määramiseks mõõdetud kõrguse ja diameetri leidmisel tehtud veast. Suurema diameetri ja väiksema kõrguse korral oleks teoreetiline Vxmax tulnud ligilähedane saadud tulemusega.