„AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL „ (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
„AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL „
laboratoorne töö
Tallinn
2012

Sisukord

Töö teoreetilised alused 3
Töö käik 4
Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine 4
Segu komponentide lahutamine 4
Proovi sisestamine 4
Fraktsioonide analüüsimine 5
Kromotogramm 6
Järeldus 7

Töö teoreetilised alused

Kromatograafia- segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse laialdaselt amiohapete, valkude, süsivesikute jt ainete segude lahutamisel.
Geelkromatograafia on meetod erinevate suurustega molekulide eraldamiseks segust .Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise , võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse, tulevad kolonnist läbi esimesena. Kõige väiksemad molekulid aga takistuvad pooridesse, ning väljuvad geelist viimastena.Geelkromotograafias protsess viiakse läbi kinnises süsteemis- kolonnis . Kolonn on täidetud geeliga, ,mille pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakriilamidist.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustasid järgmised mahud:

• Täidise maht (Vt)
  
• Kolonni vaba maht (Vv)
  
• Graanulitesisese vedeliku maht (Vs)
  
• Geelimaterjali maht (Vg)
  

Uuritava segu läbi kolonni transportimiseks ja erineva molekulmassiga ainete eraldamiseks, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega ( puhver , soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa.
Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest.
Vx – eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.
Vxmin - ehk minimaalne elueerimismaht , mis on võrdne kolonni vaba mahuga
Vv –kolonni vaba maht ( kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena.)
Vxmax - maksimaalne elueerimismaht (aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt.)Vxmax = Vt – Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf
Rf =
Kromotogramm- kromotograafia protsessi visuaalne väljund, see on graafiline sõltuvust eluaadi fraktsioonides sisuldava aine kontsentratsioon ja eluaadi mahu vahe.

Töö käik

Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine

• Kolonn nr.1. Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1.
  
• Joonlauda abiga mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 17,4 cm ja diameetri D = 2,8 cm. Arvutasin täidise kogumahu Vt = = 76,49 cm3
  
• Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k Vt = 7,65 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg = 68,84 cm.
  
• Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42.
  
• Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t)
  
• Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5,
  
• Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks.
  

Segu komponentide lahutamine

• Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP- aspartaat 0,3 mg/ml
  
• Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min
  

Proovi sisestamine

• Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale.
  
• Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine , väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 50 ml kuiva kolbi. Mõõtsin selle, sest see moodustab osa dekstraansinise elueerimismahust Vxmin . Kolvis oli 14,5 ml.
  
• Lisasin puhverlahust mööda kolonni külge , seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi.
  
• Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. Kokku oli 35 katseklaasid.
  
• Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga.
  

Fraktsioonide analüüsimine

• Mõõtsin fraktsioonide optilised tihedused, et teada saada ainete kontsentratsioonide mõõdud. Selleks kasutasin spektrofotomeetrit. Mõõtsin ainult neid fraktsioonid, milles võib silma järgi täheldada vägimatki värvust, sest täiesti värvusete fraktsioonide optilised tihedused on 0.
  
• Eluaadi maht kolvis oli Vv=14,5 ml. Kuna fraktsioone koguti 2ml kaupa, siis iga järgmise fraktsiooni maht suureneb sellest 2ml võrra.
  

Lainepikkus (nm)
Fraktsiooni nr.
Elueerimismaht V, ml
Optilien tihedus, A
670
dekstraansinine
2
18,5
0,141
3
20,5
0,301 Vxmin
4
22,5
0,176
5
24,5
0,161
6
26,5
0,012
410
müoglobiin
8
30,5
2,312
9
32,5
3,612 Vx
10
34,5
3,612 Vx
11
36,5
2,613
12
38,5
1,073
13
40,5
0,469
360
DNP- aspartaat
25
64,5
0,179
26
66,5
0,940
27
68,5
1,917 Vxmax
28
70,5
1,732
29
72,5
1,250
30
74,5
0,943
31
76,5
0,622
32
78,5
0,329

Kromotogramm

• Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine, see tähendab et tal on kõige suurem molekulaarmass. Järgmisena lahkus müoglobiin ja viimasena DNP-aspartaat, mis sisenes geeli pooridesse ning seetõttu väljus maksimaalse elueerimismahuga .
  
• Eluaadi kohumaht kuni dekstransinnise kõrgema konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vxmin = Vv = 20,05 ml.
  
• Eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 32,5 ml.
  
• Eluaadi kogumaht DNP- aspartaat kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vxmax = 68,5 ml.
  
• Arvutuslik eluaadi maht on Vxmax=68,84 ja mõõdetud on Vxmax = 68,5, erinevus ei ole liiga suur, see tähendab et töökaitse õnnetus hästi.
  
• Liikuvustegur Rf väärtus segus sisaldanud valgu (müoglobiin) jaoks:
  

Rf = =

Järeldus

Antud töös mina tutvusin geelkromotograafia meetodiga. Töö õnnestus hästi, sest arvutuslik ja mõõdetud eluaadi mahud erinesid väga vähe. Mina kasutasin kolonni nr.1 mis lahutas segusid väga kiiresti. Kolonnis oli näha kolme värvi(sinine, pruun, kollane), see tähendab, et segus oli 3 erinevat ainet ja need lahutusid üksteisest erineva kiirusega Kõige madalama molekulmassiga dekstraansinine väljus esimesena, sest tema osakesed olid liiga suured geeli pooride mahutamiseks Teisena väljus müoglobiin ja kolmandana kõige kõrgema kontsentratsiooniga DNP-aspartaat.