Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Laboratoorne töö 2.1
Üliõpilane:
Rühm:
Juhendaja :
Tallinn
Teooria
Geelkromatograafia põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine e fraktsioneerimine nende molekulmassi suuruse järgi. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega.
Kasutatakse pundunud geeligraanulitega täidetud kolonne, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega.
Geelid, mida seda liiki kromatograafias kasutatakse, koosnevad kas dekstraanist
(glükoosi plümeer , mida sünteesib bakter Leuconostoc mesenteroides), agaroosist
(lineaarne punavetikate polüsahhariid, mis sisaldab D-galaktoosi ja 3,6-anhüdro-L-
galaktoosi molekuli jääke) või polüakrüülamiidist.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:

• Täidise maht Vt
  
• Kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht Vs
  
• Graanulitesisese vedeliku maht Vs
  
• Geelimaterjali maht Vg
  

Seega Vt = Vv+ Vs+ Vg
Ainet iseloomustab elumineerimismaht e väljumismaht Vx. See on eluaadi maht, mis
on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist
väljumiseni. Kui segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli
pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, neil on minimaalne elueerimismaht
Vxmin , mis võrdub kolonni vaba mahuga.
Vxmin = Vv
Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse,
liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on
lähedane antud kolonni kogumahule. Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületab
kolonni kogumahu.
Teades geelimaatriksi mahtu Vg, võib Vxmax arvutada:
Vxmax = Vt - Vg
Geelkromatograafiat iseloomustavad kaks olulist parameetrit:

• Vv(=Vxmin)- vaba maht e eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli
  pooridesse ei mahu;
  
• Vxmax - maksimaalne elueerimismaht, eluaadi maht, mille juures väljuvad need
  molekulid, mis on võimelised graanulitesse täielikult sisenema.
  

Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende
liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf.
Rf = (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin)
Aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nim.
kromatogrammiks.
Töö käik
Kolonni iseloomustavad parameetrid:
Kasutatav geel: Sephadex G-75
Geeli pundumisaste k= 0,1
Geelisamba kõrgus L= 17
Täidise diameeter d= 2,5; r = 1,25
Täidise kogumaht Vt= П*r2*L => 3,14* 1,252*17=83,41
Geelimaatriksi maht Vg= K*Vt => 0,1*83,41=8,341
Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg => 83,41-8,341 = 75,069
Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/2 => 42,84/2 = 37,5
Katseklaasistatiivi asetati 38 katseklaasi nummerdatult. Seejärel avati kolonni väljavooluava ja reguleeriti kiirus optimaalseks (2 ml fraktsiooni kogumiseks kulub 2-3 minutit). Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, suleti kolonni väljavooluava ja kolonni sisestati pipetiga 0,5 ml uuritav proov , mis koosnes dekstraansinisest, müoglobiinist ja DNP-aspartaadist. Seejärel lisati vooluti, mis tagas, et uuritava proovi imendumise geeli. Kui proov oli imendunud, siis lasti voolutil tilkuda kolonni ühtlase kiirusega.
Uuritavas segus olid kõik komponendid värvilised, seega oli komponentide lahutamine visuaalselt jälgitav. Senikaua , kuni kolonni alaossa pole veel jõudnud kõige kiiremini liikuv
komponent , väljub kolonnist puhas vooluti, seda ei pea 2 ml fraktsioonidena koguma, kuna see poleks otstarbekas. Kui esimene värviline riba (sinine) jõuab kolonni põhja lähedale, jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml fraktsioonidena.
Oluline on, et kogu katse vältel oleks kolonni täidise kohal piisavalt eluenti ning et eluaati kogutaks täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise võib lõpetada, kui kõik värviribad on väljunud ja eluaat on värvitu. Aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendatakse lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel.
Värviliste segude puhul mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võib silma järgi värvust täheldada, värvusetute absorbtsiooni väärtused võib lugeda võrdseks nulliga. Iga aine optilise tiheduse väärtust mõõdetakse ainele iseloomulikul neeldumismaksimumi lainepikkusel λmax. Sinisele värvile vastas 670 nm, pruunile 410 nm, kollasele 360 nm.
Tulemused
Tabel 1. Mõõtmistulemused
Esmane fraktsioon 25 ml
Fraktsiooninr
Elueerimismaht
Optiline tihedus (D)
Lainepikkus
1
27
0,005
670nm
2
29
0,145
3
31
0,411
4
33
0,349
5
35
0,165
6
37
0,037/0,620 (segafraktsioon)
410nm
7
39
0,887
8
41
0,884
9
43
0,719
10
45
0,515
11
47
0,330
12
49
0,198
13
51
0,110
14
53
0,062
15
55
0
16
57
0
17
59
0
18
61
0
19
63
0,014
360 nm
20
65
0,061
21
67
0,149
22
69
0,273
23
71
0,413
24
73
0,546
25
75
0,612
26
77
0,600
27
79
0,514
28
81
0,380
29
83
0,261
30
85
0,171
31
87
0,096
32
89
0,050
Graafik 1. Kromatogramm
Järeldus
Kromatogrammi pealt on näha kolm tippu, mis seletab ainete kolonnist väljumise järjekorda . Esimesena väljus kõige suurema molekulmassiga aine – dekstraansinine, seejärel müoglobiin ning siis väikseima molekulmassiga aine – DNP- aspartaat . Dekstraansinise molekulid ei mahtunud kolonni täitva geeli pooridesse. Müoglobiini molekulid difuneerusid geeli pooridesse rohkem ning DNP- aspartaadi molekulid difundeerusid geeli pooridesse täielikult.
Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni – Vxmin = Vv = 31ml
Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 39 ml
Eluaadi maht kuni DNP-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni – Vxmax = 75 ml
Viimasena väljunud DNP-aspartaadi elueerimismaht on võrdne arvutusliku Vxmax väärtusega.
Arvutan liikuvusteguri: Rf = 39-31/75-31 = 0,18
Töö tulemusega võib rahule jääda kuna arvutuslik jakatse tulemusena saadud viimasena väljunud DNP-aspartaadi elueerimismahud on võrdsed.