SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE (0)

2. SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE
2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL
Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel.
Geelkromatograafia meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate ainete molekulmasside erinevusele. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Protsessi viiakse läbi kolonnis , mis on täidetud poorse geelimaatriksiga, kusjuures poorid on samas suurusjärgus lahutatavate makromolekulide mõõtmetega. Geeligraanulite pooridest suuremad molekulid pooridesse ei mahu ning seetõttu nimetatakse protsessi ka eksklusioonkromatograafiaks. Geelkromatograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist vōi polü-akrüülamiidist.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:

kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht (Vv),

graanulitesisese vedeliku maht (Vs),

geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg),

täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt).
Vt = Vv + Vs + Vg
Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt molekulide võimele difundeeruda geeli pooridesse. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida, voolutatakse (elueeritakse) kolonni sobiva vesilahusega ( puhver , soolalahus vm) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa.
Ainet iseloomustab elumineerimismaht e väljumismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni kolonnist.
Kui segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht Vxmin , mis võrdub kolonni vaba mahuga.
Vxmin= Vv
Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on lähedane antud kolonni kogumahule.
Vxmax= Vt
Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületab kolonni kogumahu.
Teades geelimaatriksi mahtu Vg, võib Vxmax arvutada: Vxmax= Vt-Vg
Geelkromatograafiat iseloomustavad kaks olulist suurust:

• Vv(=Vxmin)- vaba maht e. eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu
  
• Vxmax- maksimaalne elueerimismaht, eluaadi maht, mille juures väljuvad need molekulid, mis on võimelised graanulitesse täielikult sisenema
  

Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvus-teguriga Rf, mille väärtus jääb vahemikku 0...1.
Rf= (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin)
Aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nim. kromatogrammiks.
Töö käik
Kolonni iseloomustavad suurused

• Kasutatav geel Sefadex G-75
  
• Pundumistegur k=0,1
  
• Geelisamba kõrgus L= 29,5 cm
  
• Kolonni sisediameeter 2,1 cm ( r= 1,05 cm)
  

Vajalikud arvutused tööks

• Kogumaht Vt= Sp * L Sp= πr2
  

Vt= 3,14 * (1,05)2 * 29,5 = 102 cm3

• Geelimaatriksi maht Vg= k* Vt
  

Vg= 0,1* 102 = 10,2 cm³

• Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg
  

Vxmax= 102-10,2= 91,8 cm3

• Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/ 2
  

n= 91,8/2≈46 katseklaasi
Elueerimispuhver: 0,15 M NaCl; 20 mM Tris/HCl; pH= 7,5
Lahutatava segu koostis: dekstraansinine 3 mg/ml, müoglobiin 6 mg/ml, DNP- aspartaat 0,3 mg/ml
Segu komponentide lahutamine kolonnis

Avasin alumise kraani ja lasin voolutil kolonnist tilkuda väiksesse keeduklaasi kuni vooluti oli mõne mm kõrgusel geeli nivoost, jälgides, et kolonn kuivaks ei jookseks.

Sulgesin kolonni väljavooluava ning doseerisin pipetiga geeli pinnale 1 ml uuritavat proovi.

Järgmiseks lisasin tilkhaaval voolutit, et proov imenduks geeli, kuid ei lahustuks voolutis.

Kui proov oli geeli sisenenud, lisasin suurema koguse voolutit geeli pinnale.

Valmistasin ette 40 katseklaasi, kuhu fraktsioone koguda, ning asetasin ühe 100 ml keedu -klaasi väljavooluava alla, avasin kraani.

Kuni dekstraansinine lähenes kolonni põhjale, tilkus kolonnist puhas vooluti, mida kogusin eeljooksuna keeduklaasi, et seda hiljem arvestada eluaadi kogumahu arvutamisel. Pärast mõõtmist ühendatud fraktsiooni maht 33 ml.

Proovis sisalduvad ained andsid kolonnis erineva värvuse- sinine, pruun ja kollane, mida kogusin 2 ml fraktsioonidena kaliibritud katseklaasidesse. Katseklaase sain kokku 38.

Kui uuritavad ained mööda kolonni allapoole liikusid, lisasin ülevalt pidevalt eluenti, et eluendi nivoo oleks kolonni peas koguaeg sama, sest see tagab uuritav lahuse ühtlasema kiirusega läbivuse kolonnist.

Lõpetasin elueerimise, kui eluaadi summaarne maht oli sama, mis arvutuslik kogumaht.
Proovide analüüsimine
Selleks, et teada saada aine kontsentratsiooni mõõtu, mõõtsin kõikide proovide (va täiesti värvusetute) optilise tiheduse ehk absorbtsiooni . Optilist tihedust määratakse aine neeldumis-maksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetri abil.
Ainete lainepikkused:

• Sinine (Dekstraansinine) 670nm
  
• Pruun (Müoglobiin) 410nm
  
• Kollane (DNP- aspartaat) 360 nm
  

Fraktsiooni nr
Elueerumismaht
Absorbtsioon
 
(V, ml)
(A)
Eeljooks
33
0
Dekstraansinine, 670nm
 
1
35
0,0389
2
37
0,2726
3
39
0,1953
4
41
0,0406
5
43
0,0092
Müogobiin, 410nm
 
3
45
0,05
4
47
0,1163
5
49
0,4
6
51
1,1307
7
53
2,02
8
55
2,52
9
57
2,44
10
59
1,9
11
61
1,25
12
63
0,71
13
65
0,4
14
67
0,1846
15
69
0,073
16
71
0,001
17
73
0
18
75
0
19
77
0
20
79
0
21
81
0
22
83
0
23
85
0
DNP-aspartaat, 360nm
 
24
87
0,017
25
89
0,0623
26
91
0,159
27
93
0,358
28
95
0,76
29
97
1,237
30
99
1,2
31
101
0,97
32
103
0,53
33
105
0,21
34
107
0,074
35
109
0,027
36
111
0,015
37
113
0,01
38
115
0
Kogu eluaadi maht: 33+238=109 (ml)
Graafikult on näha kolme tõusu ja langust, mis näitavad, et aine konts. kolonnist väljumisel tõuseb, saavutab haripunkti ja langeb, kuni kogu aine on kolonnist väljunud. Ained jagunesid geelis vastavalt molaarmassile. Dekstraansinine, mille molaarmass oli suurim, väljus kolonnist esimesena. Tema elueerumismaht on minimaalne. Kolmandana elueerus DNP-aspartaat, mille molekulid olid lahuses väikseimad ning difundeerusid täielikult geeli pooridesse. Seetõttu on DNP-Aspartaat maksimaalse elueerimismahuga. Müoglobiin väljus kohe pärast dekstraansinist, st tema molekulmass on dektraansinisest veidi väiksem. Müogobiini ja DNP- aspartaadi väljumise vahe oli suurem, st DNP-aspartaadi molekulid on oluliselt väiksemad müoglobiini omadest.
eluaadi kogumaht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni
Vx1= Vxmin= 33 +22= 37 ml
eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni
Vx2= 33 + 2 8= 49 ml
eluaadi kogumaht kuni DNP-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni
Vx3= Vxmax= 33 + 2
29= 91 ml
Arvutatud Vxmax= 91,8 cm3 Mõõdetud Vxmax= 91 cm3
Müoglobiini liikuvusteguri Rf väärtus, kasutades arvutuslikku Vxmax väärtust
Rf= (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin)= (49-37)/(91,8-37)≈0,22
Järeldused
Katse põhjal võis kindlaks teha, et suurim molekulmass on dekstraansinisel, talle järgneb väikese vahega müoglobiin ning väikseimat molekulaarmassi omab DNP-aspartaat. Kromatogrammil on ainete kontsentratsioonide üleminekud kindlalt piiritletud ning sujuvad.