Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

Tallinna Tehnikaülikool

Bioorgaanilise keemia õppetool
2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Tallinn 2013

2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil

Töö teoreetilised alused
Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia on segu komponentide lahutamise ehk fraktsioneerimise meetod, mis põhineb aine molekulmassidel ja nende erineval jaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel.
Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise , võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse (vastavalt molekuli suurusele).
Geelkromatograafias kasutatavd geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist (margid erinevad üksteisest poorsuse poolest).
Uuritava segu läbi kolonni transportimiseks ja erineva molekulmassiga ainete eraldamiseks, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega ( puhver , soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa.
Geelkromatograafia kolonne iseloomustavad mahud:
Täidise üldmaht
Vt
Kolonni vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht)
Vv
Graanulitesisese vedeliku maht
Vs
Geelimaterjali (maatriksi) maht
Vg
Vt=Vv+Vs+Vg
Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest.
Vx – eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.
Vxmin ehk minimaalne elueerimismaht = Vv – kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena.
Vxmax ehk maksimaalne elueerimismaht =≈ Vt - aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt.
Vxmax = Vt – Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin
Töö käik
Kolonn ja selle ettevalmistamine:

• Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex fine G-75 k=0,1.
  
• Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 16,8 cm ja diameetri d = 2,7 cm →r= 1,35cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = L·πr2 = 114,45
  
• Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 11,44 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg = 103,01
  
• Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53
  
• Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks.
  

Segu komponentide lahutamine:

• Segu nr. I: Dekstraansinine , müoglobiin, DNP- aspartaat .
  
• Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 – 1,0 ml/min (eesmärgiga koguda iga fraktsioon umbes 2-3 minutiga).
  

Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine:

• Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin automaatpipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale.
  

• Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 100 ml kuiva kolbi. ( hakkasin koguma fraktsiooni, kui sinine värv oli alt kuskil 3-4 cm kaugusel) Mõõtsin selle, kuna see moodustab osa dekstraansinise elueerimismahust Vxmin .
  

Ühendatud fraktsiooni maht: 20 ml.

• Selleks, et uuritav proov siseneks täidisesse täielikult kandsin geeli pinnale kiiresti peale segu umbes 2 ml voolutuslahust ja kordasin protsessi seni kuni, olin veendunud, et proov on täielikult täidises. Lõpuks kandsin geeli pinnale suurema koguse voolutit.
  
• Kui sinine riba (dekstraansinine) hakkas lähenema kolonni põhjale, eemaldasin ühendatud fraktsiooni kolvi kolonni alt ja alustasin 2 ml mahuga fraktsioonide kogumist katseklaasidesse. Elueerimise ja fraktsioonide kogumise lõpetasin kui eluaat muutus värvituks.
  
• Fraktsioonide analüüsimine:
  

• Mõõtsin kõikide fraktsioonide optilised tihedused , et teada saada ainete kontsentratsioonide mõõdud. Selleks kasutasin spektrofotomeetrit.
  Dekstraansinine: 670 nm
  Müoglobiin: 410 nm
  DNP-aspartaat: 360 nm
  

• Eluaadi maht kolvis oli Vv=23 ml. Kuna fraktsioone koguti 2ml kaupa, siis iga järgmise fraktsiooni maht suureneb sellest 2ml võrra.
  

Lainepikkus (nm)
Fraktsiooni nr.
Eluaadi maht (ml)
Optiline tihedus (ABS)
 
670
1
22
0,040
 
 
2
24
0,059
 
3
26
0,186
dekstraansinine
4
38
0,25
 
5
30
0,171
 Vxmin
 
6
32
0,086
 
 
7
34
0,065
8
38
0, 2610 (Üleminek)
410
9
40
0,2533
 
 
10
42
0,4868
 
müoglobiin
11
44
1,2269
 
 
12
46
1,5891
 Vx 
 
13
48
1,455
 
14
50
1,1455
 
 
15
52
0,612
 
 
16
54
0,3522
 
 
17
56
0,318
 
 
19
58
0,099
 
 
20
60
0,044
 
 
21
62
0,016
 
22
64
0
23
66
0
24
68
0
25
70
0
26
72
0
27
74
0
28
76
0
29
78
0
30
80
0
31
82
0
32
84
0
33
86
0
34
88
0
35
90
0
360
36
92
0,2163
 
 
37
94
0,2179
 
DNP-aspartaat
38
96
0,2379
 
 
39
98
0,3331
 
 
40
100
0,5526
 
41
102
0,8652
 
42
104
1,0271
 
 
43
106
0,9344
Vxmax
 
44
108
0,7263
 
 
45
110
0,5044
 
 
46
112
0,3405
 
 
47
114
0,2659
 
 
48
116
0,131
 
 
Lainepikkus (nm)
Fraktsiooni nr.
Eluaadi maht (ml)
Optiline tihedus (ABS)
 
670
1
24
0,040
 
 
2
26
0,059
 
3
28
0,186
dekstraansinine
4
30
0,250
Vxmin
 
5
32
0,171
 
 
6
34
0,086
 
 
7
36
0,065
8
38
0,023 (Üleminek)
410
9
40
0,246
 
 
10
42
0,511
 
müoglobiin
11
44
0,852
 
 
12
46
1,140
 
 
13
48
1,203
Vx 
 
14
50
1,126
 
 
15
52
0,853
 
 
16
54
0,569
 
 
17
56
0,318
 
 
18
58
0,188
 
 
19
60
0,099
 
 
20
62
0,044
 
 
21
64
0,016
 
22
66
0
23
68
0
24
70
0
25
72
0
26
74
0
27
76
0
28
78
0
29
80
0
30
82
0
31
84
0
32
86
0
360
33
88
0,066
 
 
34
90
0,162
 
DNP-aspartaat
35
92
0,284
 
 
36
94
0,452
 
 
37
96
0,628
 
38
98
0,999
 
39
100
1,314
 
 
40
102
1,447
Vxmax
 
41
104
1,313
 
 
42
106
1,045
 
 
43
108
0,621
 
 
44
110
0,318
 
 
45
112
0,131
 
Tulemused ja nende interpreteerimine
Arvutan kogu eluaadi mahu: 23 + 2*45 = 113
Graafikult ja ka tabelist on hästi näha, et kõikide värvuste puhul esineb fraktsioonides tõusu ja langusi, mis näitab, et aine konsentratsioon tõuseb kolonnist väljumisel, kuni saavutab oma haripunkti ja seejärel hakkab langema , kuni kogu aine on kolonnist lahkunud.
Kõige suurema molekulaarmassiga oli dekstraansinine,mis väljus kolonnist esimesena. Järgmisena lahkus müoglobiin ja viimasena DNP-aspartaat, mis sisenes geeli pooridesse ning seetõttu väljus viimasena maksimaalse elueerimismahuga.
1)Eluaadi kogumaht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni
Vxmin= 30 ml
2)Eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni
Vx= 48 ml
3)Eluaadi kogumaht kuni DNP- aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni
Vxmax= 102 ml

Mõõdetud ja arvutusliku Vxmax erinemine:
Mõõdetud Vxmax = 102 ml; arvutuslik Vx(max)= 103,01 ml
Töö õnnestus üpriski hästi, sest mõõdetud ja arvutatud Vxmax erinesid suhteliselt vähe.
Müoglobiini liikuvusteguri väärtus (segus sisaldunud valk): Rf = Vx – Vxmin / Vxmax – Vxmin = 48 – 30 / 102 – 30 = 18 / 72 = 0,25