Biokeemia praktikum. Töö 2.1 Geelkromatograafia (0)

Biokeemia praktikumi protokoll
Töö 2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Üliõpilane: Jaroslav Marhivka (rühm B)
Juhendaja : Ly Villo
Teaduskond ja eriala: Matemaatika - ja loodusteaduskond, Geenitehnoloogia
Matrikli Nr :134369 YAGB
Sissejuhatus
Geelkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest , mis põhineb lahuses olevate ainete lahutamisel nende molekulmassi suuruse järgi. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, ühtlase poorsusega geeli erineva kiirusega. Seda meetodit kasutatakse makromolekulide segude lahutamiseks, puhvri vahetamiseks ja lisandite eemaldamiseks. Proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. Kolonnis oleva geeli graanulite pooride suurus on samas suurusjärgus segu makromolekulide dimensioonidega. Geelid koosnevad dekstraanist (glükoosi polümeer), agaroosist (punavetikate lineaarne polüsahhariid) või polüakrüülamiidist (kopolümeer, mis koosneb akrüülamiidi ja -metüleen-bis-akrüülamiidi molekulidest).
Kolonni iseloomustavad mahud:

• Granulitevahelise vedeliku maht ().
  
• Graanulitesisese vedeliku maht ().
  
• Geelimaterjali ehk maatriksimaht ().
  
• Täidise kogumaht ehk üldmaht ().
  

Kolonnist väljuvat lahust kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis sisaldub segus, iseloomustab väljumis- ehk elueerimismaht . Aine x elueerimismaht
on selline eluuadi maht, mille juures kolonnist väljuvas fraktsioonis on aine x kontsentratsioon maksimaalne.
Minimaalne elueerimismaht – selline elueermismaht, mille juures kolonnist väljuvad kõige suuremad molekulid (=).
Maksimaalne elueerimismaht – selline elueerimismaht, mille juures kolonnist väljuvad ka need molekuli, mille molekulid täielikult diffundeeruvad geeli pooridesse (=).
Aineid, mille molekuli suudavad täielikult diffundeerida geeli pooridesse ja mille
antud kolonnis on teada, iseloomustatakse liikuvusteguriga :
Selle värtusedjäävad vahemiku 0...1
Töö käik

Proovi andmed: =0.5 ml. Koostis: Dekstraansinine (6 mg/ml), Müoglobiin (6 mg/ml), DNP- aspartaat (0.3mg/ml), proovi lahusti ja eluent – NaCl lahus.

Märgin ära kolonni andmed: geel on Sephadex G-75, koeffitsient k=0.1, geelisambla kõrgus L=27.4 cm, diameeter d=1.9 cm.

Arvutan vajalikud mahud:

Arvutan fraktsioonide üldarv: n= (tegelikult 29-s fraktsioonis oli nii vähe elueerivat ainet, et sellega ma lõpetasin fraktsioonide kogumist).

Asetan katseklaase statiivi ja nummerdan neid.

Geeli kohal olevat lahust kogun eraldi keeduklaasi (19.5 ml)

Kogun fraktsioone (29). Iga fraktsioon ~2 ml.

Mõõdan kogutud fraktsioonide absorptsioonid. 1-3 fraktsioonid lainepikkusel 670 nm, 4-10 fraktsioonid lainepikkusel 410 (4 fraktsioon kahel lainepikkusel) nm ja 11, 12, 19-29 fraktsioonid lainepikkusel 360 nm (fraktsioonid 13-18 on tühjad, nende A on 0).
Arvutan eluuerimismahud arvestades, et iga fraktsiooni elueerimismaht võrdub ühendatud fraktsiooni ja fraktsiooni mahtude summaga : 19.5+2*n , kus n on fraktsiooni number.
Fraktsiooni number
Elueerimismaht , ml
Optiline tihedus, A
Ühendatud fraktsioon
19.5
0
1
21.5
0.005
2
23.5
0.123
3
25.5
0.157
4
27.5
0.119
5
29.5
0.228
6
31.5
0.629
7
33.5
0.662
8
35.5
0.461
9
37.5
0.252
10
39.5
0.125
11
41.5
0.052
12
43.5
0.004
13
45.5
0
14
47.5
0
15
49.5
0
16
51.5
0
17
53.5
0
18
55.5
0
19
57.5
0.038
20
59.5
0.086
21
61.5
0.170
22
63.5
0.245
23
65.5
0.293
24
67.5
0.298
25
69.5
0.225
26
71.5
0.136
27
73.5
0.083
28
75.5
0.047
29
77.5
0.026

Koostan kromatogramm
Sinine graafiku osa kajastab dekstraansinise kontsentratsiooni muutumist, kollane – müoglobiini kontsentratsiooni muutumist ja punane – DNP- aspartaadi kontsentratsiooni muutumist. Roheline osa graafikust on need proovid , milles uuritavaid aineid ei olnud.
Dekstraansinine vüljuv kõige esimesena, kuna see on polüsahhariid ja selle molekulmass on
, teisena väljub müoglobiin (molekulmass 16800), kolmandana – DNP-aspartaat (molekulmass ~300).

Arvutan müoglobiini väärtust:
Järeldus
Töö on tehtud korrektselt, kuna arvutuslik
ja praktiline
erinevad üks teisest vähe. Fraktsioonid väljusid kolonnist vastavalt nende suurustele. Erinevus arvutusliku fraktsioonide arvu ja praktilise fraktsioonide arvu vahel on tingitud sellest, et kõik minu kogutud fraktsioonid ei olnud täpselt 2 ml (mõned olid suurema mahuga).