Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

5 VÄGA HEA

TTÜ keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetööl
YKL0060 Biokeemia
Laboratoorne töö nr: 2.1
Töö pealkiri: Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Õpperühm:
YASB 21
Töö teostaja : Kati Muldma 123907
Õppejõud: Tiina Randla
Töö teostatud:
27.02.2013
Protokoll esitatud:
12.03.13

Töö teoreetilised alused

Töö eesmärk

Eesmärgiks oli ette antud lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmasside suuruse järgi. Seda saab läbi viia geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafiaga, mis on üks kromatograafia meetoditest. Tänu ainete erinevale molekulmassile liiguvad nad geelist läbi erineva kiirusega, kusjuures geeli poorsus peab olema selleks võimalikult ühesugune. Seda meetodit võib kasutada makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks.

Segu geelkromatograafilise lahutamise põhimõte

Protsess viiakse läbi kolonnis , mis on kinnine süsteem ja ta on täietud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on umbes sama suured lahuses olevate makromolekulide dimensioonidega. Geelid, mida kasutatakse koosnevad dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist.
Kui juhtida läbi kolonni erineva molekulmassiga ainete segu, siis vastavalt molekulide võimele difundeeruda geeli pooridesse lahutuvad nad üksteisest. Et uuritavat ainet läbi kolonni transportida ja, et erinevad molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobivat vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa.
Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on kaks olulist parameetrid : 1) kolonni vaba mahtu Vv (= Vxmin ) ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu. 2) maksimaalset elueerimismahtu Vxmax ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad.
Liikuvusteguriga Rf iseloomustatakse aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja, mille elueerimismaht on kolonnis kindlaks määratud.
Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline sõltuvus.

Töö käik

Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine

Kontrollisin kolonni vertikaalsust.
Märkisin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex’i margi ja seda iseloomustava teguri k.

Sephadex’i mark: G-75
k = 0,1

Mõõtsin geelisamba ehk täidise kõrguse L ja diameetri d, kasutades sobivat joonlauda.

L = 17,6 cm
d = 3 cm

Arvutasin täidise kogumahu Vt.

Vt = L * r2 * π = 17,6 * 1,52 * π = 124,4 cm3

Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueelirimismahu Vxmax = Vt - Vg

Vg = 0,1 · 124,4 cm3 = 12,44 cm3
Vxmax = 124,4 cm3 – 12,44 cm3 = 111, 96 cm3

Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2ml; seega

n = Vxmax / 2 = 111,96 cm3 / 2 = 55, 98 ≈ 56

Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastava hulga kindla mahu järgi ( 2ml ) kalibriitud katseklaase ja numereerisin need.
Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahutuse ehk eluendi pudeli ja märkisin üles voolutuslahuse koostise:

50 mM Tris – HCl
150mM NaCl
pH = 7,5

Varusin väikse keedkulaasi, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lasin.

2.2. Segu komponentide lahutamine

Avasin ettevaatlikult kolonni väjavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonnist välja tilkuma. Reguleerisin kolonni voolukiiruse optimaalseks. Kui vedeliku tase langes kolonnis täidise pinnani, sulgesin kolonni väljavooluava ja kolonn sai valmis proovi sisetamiseks.

Proovi sisestamine

Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin pipetti. Viisin 0,5 ml uuritavat proovi kolonni, juhtides pipeti otsa vastu kolonni seina. Proovil lasksin voolata geeli pinnale nii, et see jaotuks võimalikult ühtlaselt.

Uuritavad segud

Uuritav segu koosnes järgnevatest ainetest:
Dekstraansinine ( 6 mg/ml )
Müoglobiin ( 6 mg/ml )
DNP – aspartaat ( 0,6 mg/ml )

2.4 Kolonni voolutamine

Kui proov on täidisesse sisenenud, viin pipetiga geeli pinnale väikse koguse voolutuslahust ja lasen täidisesse imbuda. Kordan seda nii kaua, kuni kogu uuritava proov on kolonni sisenenud ja siis võib geeli pinnale kanda suurema hulga voolutit.
Kui esimene värviline riba ( dekstraansinine ) läheneb kolonni põhjale, siis eemaldab kolonni alt kolvi ühendatud fraktsiooniga ja hakkan koguma eluaati 2ml kaupa katseklaasidesse.
Mõõdan ühendatud fraktsiooni mahu: 22 ml .

Fraktsioonide analüüsimine

Aine kontsentratsiooni väljendatakse igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused, millel mõõtmine toimus, sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest. Absorbtsiooni mõõtsin spektrofotomeetritel.

Tulemused ja nende interpreteerimine

Kolonni iseloomustavad parameetrid

Täidise mark:

Sephadex’i mark: G-75

Täidist iseloomustav pundumistegur :

k = 0,1

Täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter:

L = 17,6 cm
d = 3 cm
mõõtmisviga d = 2,5 cm

Arvutatud täidise kogumaht Vt.

Vt = L * r2 * π = 17,6 * 1,52 * π = 124,4 cm3
Vt = L * r2 * π = 17,6 * 1,252 * π = 86,4 cm3

Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueelirimismahu Vxmax = Vt - Vg

Vg = 0,1 · 124,4 cm3 = 12,44 cm3
Vg = 0,1 · 86,4 cm3 = 8,64 cm3
Vxmax = 124,4 cm3 – 12,44 cm3 = 111, 96 cm3
Vxmax = 86,4 cm3 – 8,64 cm3 = 77,76

Arvutuslik fraktsioonide üldarv n:

n = Vxmax / 2 = 111,96 cm3 / 2 = 55, 98 ≈ 56
n = Vxmax / 2 = 77,76 cm3 / 2 = 38,88 ≈ 39

Voolutuslahuse koostis:

50 mM Tris – HCl
150mM NaCl
pH = 7,5
B.Katseandmete tabel ja kromatogramm
Fraktsiooni nr
Elueerimismaht
V, ml
Optiline tihedus, A
Ühendatud fraktsioon
22
0
1
24
0,044
2
26
0,052
3
28
0,454
4
30
0,509
5
32
0,434
6
34
0,046
7
36
0,099
8
38
0,173
9
40
0,638
10
42
1,189
11
44
0,914
12
46
0,523
13
48
0,203
14
50
0,105
15
52
0,074
16
72
0,122
17
74
0,357
18
76
1,034
19
78
1,500
20
80
1,241
21
82
0,821
22
84
0,517
23
86
0,335
24
88
0,226
25
90
0,168
26
92
0,129
27
94
0,093
28
96
0,072

Järeldused kromatogrammist:

Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine, sest selle aine molekulmass oli liiga suur, et mahtuda kolonni täitva geeli pooridesse. Seega oli tal minimaalne elueerimismaht Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga.
Teisena väljus kolonnist müoglobiin, sest selle molekulid difundeerusid kasutatava geeli pooridesse.
Kolmandana väljus kolonnist DNP – aspartaat, sest selle aine molekulmass oli nii väike, et see difundeerus täielikult geeli pooridesse ja liikus kolonnist kõige aeglasemalt välja. Elueerimismaht on maksimaalne Vxmax

Viimasena väljunud komponendi elueerimismahu võrdlus arvutusliku Vxmax väärtusega.
Vxmax (tegelik) = 54 ml Vxmax (tegelik) = 78 ml
Vxmax (arvutuslik) = 111,96 ml ≈112 ml Vxmax (arvutuslik) = 77,76 ml ≈78 ml
Arvutuslik Vxmax-i on oluliselt suurem tegelikust Vxmax –ist. Selline viga tekkis ilmselt seetõttu, et ma ei kandnud proovi geelile ühtlaselt. Viga võis tekkida ka kolonni diameetri ja kõrguse mõõtmisel, mis viis arvutusliku Vxmax-i veani.
Arvestades kolonni diameetri mõõtmise viga, tulevad arvutuslik ja tegelik Vxmax võrdsed.

Liikuvusteguri Rf väärtus.
Rf = Vx – Vxmin / Vxmax - Vxmin = (18 – 6)/(111,96 – 6) = 0,1133
Rf = Vx – Vxmin / Vxmax - Vxmin = (40 – 28)/(77,76 – 28) = 0, 2412

KOKKUVÕTE

Eraldasin geelkromatograafiliselt kolme erineva molekulmassiga ained segust . Katse oleks võinud õnnestuda paremini. Viga tekkis kohe katse alguses, kui viisin uuritavat lahust geelile, ei saanud ma seda ühtlaselt jaotatud. Ka kulus katses palju vähem katseklaase, kui ma välja arvutasin, ilmselt selle pärast, et alguses kogusin nullfraktsiooni.
Kui arvestada kolonni diameetri mõõtmise viga, siis ülejäänud andmed klapivad, seega katse õnnestus.

.DOCX Laadi alla originaalfail 10 lk · .docx · 9 allalaadimist

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil #1

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil #2

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil #3

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil #4

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil #5

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil #6

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil #7

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil #8

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil #9

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil #10

5 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 5 punkti.

~ 10 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2013-04-28 Kuupäev, millal dokument üles laeti

9 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

olentark Õppematerjali autor

kolonn molekulmass kromatograafia elueerimismaht molekulmassiga elueerimismaht voolutuslahus diameetri Ainete segu lahutamine Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil

Sarnased õppematerjalid

docx

2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil - Biokeemia labori protokoll

Tallinna Tehnikaülikool 2.2 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Biokeemia labori protokoll 2011 Töö teoreetilised alused Geelkromatograafia on kromatograafia meetod, mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine. Ained fraktsioneeritakse nende molekulmassi järgi, see tähendab, et erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Proovi transportimine läbi kolonni toimub vesilahuse abil. Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis kolonnis. Kolonn on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on vastavuses lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega.

Biokeemia

docx

„AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL „

Tallinna Tehnikaülikool Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool ,,AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL ,, laboratoorne töö Tallinn 2012 Töö teoreetilised alused Kromatograafia- segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse laialdaselt amiohapete, valkude, süsivesikute jt ainete segude lahutamisel. Geelkromatograafia on meetod erinevate suurustega molekulide eraldamiseks segust.Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise , võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega

Biokeemia

docx

SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE

2. SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE 2. A Kromatograafilised meetodid Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva, mida nimetatakse ka mobiilseks faasiks, ja liikumatu, mida saab nimetada ka statsionaarseks, faasi vahel. Mobiilse faasi agregaatolekust sõltuvalt eristatakse gaasi-, vedelik- ja ülekriitilise fluidumi kromatograafiat. Statsionaarse faasina võib kasutada adsorbenti, ioniiti, biospetsiifilist sorbenti, poorset geeli või kandja pooridesse seotud vedelikku. Sõltuvalt statsionaarse

rekursiooni- ja keerukusteooria

doc

Geelkromatograafia

TTÜ Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool YKL0060 Laboratoorne töö: nr. 4 Töö pealkiri: 2.2 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Õpperühm: YAGB22 Töö teostaja: Õppejõud: Töö teostatud: 12.04.2010 Protokoll esitatud: 16.05.2010 2.2 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Töö teoreetilised alused: Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia on segu komponentide lahutamise ehk fraktsioneerimise meetod, mis põhineb aine molekulmassidel ja nende erineval jaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise , võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse (vastavalt molekuli suurusele).

Biokeemia

docx

Geelkromatograafia

2. Segude lahutamine ja ainete identifitseerimine 2.1 Kromatograafilised meetodid KROMATOGRAAFIA - meetod, millega saab ainete segu lahutada komponentideks ning mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. MOBIILNE FAAS STATSIONAARNE FAAS Agregaatolekust sõltuvalt eristatakse: Faasina võib kasutada: - Gaasikromatograafiat - Adsorbenti - Vedelikkromatograafiat - Ioniiti - Ülekriitilise fluidumi kromatograafiat - Biospetsiifilist sorbenti

Keemia

docx

Ainete lahutamine geelkromatograafia meetodil

Tallinna Tehnikaülikool 2.1 Ainete lahutamine geelkromatograafia meetodil Liina Reimann 134537KATB Kromatograafia- segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse laialdaselt aminohapete, valkude, süsivesikute jt ainete segude lahutamisel. Geelkromatograafia on meetod erinevate suurustega molekulide eraldamiseks segust. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega

Bioorgaaniline keemia

docx

Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil

Tallinna Tehnikaülikool Bioorgaanilise keemia õppetool 2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Tallinn 2013 2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Töö teoreetilised alused Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia on segu komponentide lahutamise ehk fraktsioneerimise meetod, mis põhineb aine molekulmassidel ja nende erineval jaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise , võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse (vastavalt molekuli suurusele).

Keemia

pdf

2.1 Geelkromatograafia

YKL0060 Biokeemia Töö nr 2.1 Ainete lahutamine geelkromatograafia meetodil Yasb 21 Juhendaja Tiina Randla 17.02.2012 Teooria Geelkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest, mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine ehk fraktsioneerimine nende molekulmassi suuruse järgi. Erineva molekulaarmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Meetodit kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite ja soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, kus proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis kolonnis, mis on täidetud pundunud

rekursiooni- ja keerukusteooria

Rohkem sarnaseid