Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

Töö nr 2.1
Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Koostas:
Juhendaja : Mart Reimund
Teoreetilised alused
Geelkromatograafia – üks kromatograafia meetoditest, mis põhineb lahuses sisalduvate ainete lahutamisel nende molekulmassi järgi.
Erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi geeli erineva kiirusega, kusjuures suured molekulid väljuvad enne, kuna ei mahu täidise pooridesse, väikesed molekulid aga sisenevad pooridesse ja seega nende liikumine aeglustub. Molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt molekulide võimele difundeeruda geeli pooridesse.
Kolonn on kinnine süsteem, milles viiakse geelkromatograafia protsess läbi, proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil.
Kolonni iseloomustavad suurused:
Vv – vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht)
Vs - graanulitesisese vedeliku maht
Vg – geelimaterjali ehk maatriksi maht
Vt - täidise üldmaht
Vt = Vv + Vs + Vg
Geelkromatograafias kasutatavad geelid võivad olla erineva koostisega, need on tavaliselt kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist.
Iga ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mis on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.
Molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse väljuvad kolonnist esimesena ehk minimaalse elueerimismahuga, see aga on võrdne kolonni vaba mahuga.
Vx min = Vv
Vastupidises olukorras, kui molekulmass on piisavalt väike täielikult geeli pooridesse difundeerumiseks, siis need molekulid liiguvad kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga, mis vastab peaaegu kasutatava kolonni kogumahule.
Vx max = Vt
Maksimaalse elueerimismahu saab arvutada, kui geelimaatriks on teada: Vx max = Vt - Vg
Liikuvustegurit Rf kasutatakse nende ainete iseloomustamiseks, mis suudavad geeli pooridesse difundeeruda ja mille elueerimismaht on kindlaks määratud.
Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min
Kromatogramm – graafiline sõltuvus aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahel
Töö käik
Esmalt märkida üles vajalikud andmed ning teha arvutused
Täidise mark: Sephadex G75
Täidist iseloomustav pundumistegur k= 0,1
Geelisamba kõrgus L= 25,5 cm
Kolonni sisediameeter d= 1,6 cm  r= 0,8 cm
Voolutuslahuse koostis: 0,15M NaCl
Proovi koostis: Dextrane blue 6mg/ml, Müoglobiin 6mg/ml, DNP- aspartaat 0,3mg/ml
Arvutasin välja:
Vt = ∏r2 * L= 3,14 * 0,64 * 25,5 = 51,27 cm3
Vg= k*Vt = 0,1 * 51,27 = 5,127 ml
Vx max = Vt – Vg = 51,27 – 5,127 = 46,143 ml
N= Vx max /2 = 46,143 /2 = 23,1 tk
Pärast ettevalmistuste tegemist avada ettevaatlikult kolonni voolutusava ning kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, siis taas sulgeda kolonni väljavooluava. Kolonn on valmis proovi sisestamiseks.
Proovi lisada 0,5 ml ning lisada ettevaatlikult, nii et proov voolaks geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks. Avada väljavool kolonnist ning hakatakse eluaati koguma. Kui proov on täidisesse sisenenud, viiakse geeli pinnale kiiresti väike kogus voolutuslahust, sama korratakse paar korda ning alles siis võib geeli pinnale kanda suurema koguse lahust.
Uuritavas segus on kõik komponendid värvilised, seega segu komponentide lahutumine on ka visuaalselt jälgitav. Senikaua, kuni kolonni alaossa pole veel jõudnud kõige kiiremini liikuv komponent , väljub kolonnist puhas vooluti, seda ei pea 2 ml fraktsioonidena koguma, kuna see poleks otstarbekas.
Kui esimene värviline riba (sinine) jõuab kolonni põhja lähedale, jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml kaupa fraktsioonidena.
Oluline on, et kogu katse vältel oleks kolonni täidise kohal piisavalt eluenti ning et eluaati kogutaks täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise võib lõpetada, kui kõik värviribad on väljunud ja eluaat on värvitu.
Aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendatakse lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel.
Värviliste segude puhul mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võib silma järgi värvust täheldada, värvusetute absorbtsiooni väärtused võib lugeda võrdseks nulliga.
Nb! Iga aine optilise tiheduse väärtust mõõdetakse ainele iseloomulikul neeldumismaksimumi lainepikkusel λmax. Sinisele värvile vastas 670 nm, pruunile 410 nm, kollasele 360 nm.
KATSEANDMETE TABEL
Fraktsiooni nr
Elueerimismaht V,ml
Optiline tihedus, A
Ühendatud fraktsioon
14
0
1
16
0,397
2
18
0,520
3
20
0,081
4
22
1,417
5
24
1,728
6
26
1,068
7
28
0,416
8
30
0,138
9
32
0,065
10
34
0,037
11
36
0
12
38
0
13
40
0
14
42
0,139
15
44
0,601
16
46
1,229
17
48
1,120
18
50
0,518
19
52
0,155
20
54
0,055
KROMATOGRAMM
Miks komponendid väljusid just niisuguses järjekorras?
Kõige enne väljub kõige suurema molekulmassiga aine, kõige hiljem aga kõige väiksema molekulmassiga aine.
Ained väljusid sellised järjekorras: sinine ( dekstraansinine ), pruun (müoglobiin), kollane (DNP-aspartaat). Sellest saab järeldada, et kõige suurem molekulmass on dekstraansinisel, kõige väiksem DNP-aspartaadil ning müoglobiini molekulmass jääb nende ainete vahele.
Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni
Vx min = Vv = 17,5 ml
Eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 23,5 ml
Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud komponendi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx max = 46,5 ml
Võrdlen viimasena väljunud komponendi elueerimismahtu arvutusliku Vx max väärtusega. Kui töö on korrektselt läbi viidud , peaksid need kokku langema .
Vx max = 46,5 ml
Vx max arvutuslik= 46,1 ml (46,143 ml)
Arvud on päris sarnased, seega võin lugeda töö õnnestunuks.
Arvutan liikuvusteguri Rf väärtuse segus sisaldunud valgu jaoks, kasutades arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vx max väärtust.
Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min
Rf= (23,5 – 17,5) / (46,1 – 17,5) = 0,21