TTÜ Biokeemia praktikum: Geelkromatograafia (0)

TÖÖ 2.1: AINETE SEGU LAHUTAMINE  GEELKROMATOGRAAFIA  MEETODIL 

Juhendajad:
Kaia Kukk
Priit Eek
Teooria
Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest , mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine ehk fraktsioneerimine nende molekulmasside, täpsemalt molekulide enda suuruste järgi. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, kusjuures proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil.
Geelkromatograafia protsess viiakse läbi kinnises süsteemis – kolonnis , mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:

• kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht Vv
  
• graanulitesisese vedeliku maht Vs
  
• geelimaterjali ehk maatriksi maht Vg
  
• täidise kogumaht ehk üldmaht Vt
  

Vt = Vv + Vs + Vg
Kui läbi geelkromatograafia kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu, siis molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurusele st vastavalt molekulide võimele difundeeruda geeli pooridesse. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida, voolutatakse (elueeritakse) kolonni sobiva vesilahusega (puhver) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa.
Iga ainet mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus sisalduva aine väljumismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.
Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st minimaale elueerimismahuga Vxmin , mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga.
Ained mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt.
Vxmax = Vt - Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on kindlaks määratus, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf.
Rf = Vx – Vxmin / Vxmax - Vxmin
Töö käik

• Kontrollitakse kolonni vertikaalsust
  
• kolonni täidis: Sephadex G-75, tegur k = 0,1
  
• geelisamba kõrgus l = 31,4 cm
  
• diameeter d = 1,6 cm
  
• täidise kogumaht Vt = 63 ml
  
• geelimaatriksi maht Vg = 0,1 ∙ 63 = 6,3 ml
  

• maksimaalne elueerimismaht Vxmax = 63 – 6,3 = 56,7 ml
  

• fraktsioonide üldarv n = 56,7 / 2 = 29
  
• statiivi võetakse vastav arv katseklaase
  
• eluendi koostis: 50nM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH = 7,5
  
• uuritav segu:
  
  • dekstraansinine (6mg/ml)
    
  • müoglobiin (6mg/ml)
    
  • 2,4-dinitrofenüülaspartaat (0,6mg/ml)
    
• kolonni täidise pinnal olev eluent lastakse välja
  
• kolonni voolukiirus reguleeritakse piiridesse 0,7 – 1,0 ml/min
  
• kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava
  
• kolonni pipeteeritakse 0,5 ml uuritavat proovi, lastes proovil geelile mõne millimeetri kõrguselt tilkuda nii, et proov jaotuks geelis ühtlaselt
  
• avatakse väljalaskeava ja kui proov on täielikult geeli sisenenud, hakatakse juurde lisama eluenti, alguses väiksemate kogustena jälgides, et geel ei jääks kuivaks
  
• kuni kolonni allaossa jõuab dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti, mis kogutakse ühendatud fraktsioonina kuiva 100 ml kolbi
  
• ühendatud fraktsioon 16,75 ml
  
• 2ml suuruseid fraktsioone kogutakse, kuni kogu uuritav aine on kolonnist väljunud ja eluaat on värvitu
  

Fraktsiooni analüüsimine
Aine kontsentratsioon igas fraktsioonis väljendatakse lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetritel.
Sinised fraktsioonid mõõdetakse lainepikkusel 670nm, pruunid lainepikkusel 410nm ja kollased lainepikkusel 360nm.
Koostatakse katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele.
Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine (molekulmass 2 000 000 Da), mis ei läbinud geeli poore ja väljus minimaalse elueerimismahuga. Teisena väljus müoglobiin (molekulmass 17 800 Da), mis osaliselt difundeerus geeli. Viimasena väljus DNP- aspartaat (molekulmass 299 Da), millel on võrreldes teistega väga väike molekulmass ning seetõttu difundeerus täielikult geeli pooridesse.
Eluaadi maht kuni deksrtaansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni oli
Vxmin = 20,75 ml
Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni oli
Vx = 28,75 ml
Eluaadi maht kuni DNP- aspartaadi kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni oli
Vxmax = 57,75
Arvutatud ja katselise Vxmax erinevus on 1,05ml
Suhteline viga ∆=57,75−56,757,75=1,82%
Rf müoglobiini jaoks:
Järeldus
Töö käigus eraldati segu koostises olevad kolm ainet molekuli suuruse järgi. Töö oli edukas, ained eraldusid selgelt ning õiges järjekorras. Tegeliku ja arvutatud Vxmax suhteline viga oli 1,82%, mis on väike ja võis mõningase mahulise ebatäpsuse tõttu fraktsioonide kogumisel.