AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL (0)

TTÜ Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Töö nr. 2.1
AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL
Geelkromatograafia e geelfiltratsioonkromatograafia on kromatograafia meetod, mille põhimõtte on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi. Erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks.
Geelkromatograafias viiakse protsess läbi kinnises süsteemis, mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad mahud:

• Vv -kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht
  
• Vs -graanulitesisese vedeliku maht
  
• Vg -geelimaterjali ehk maatriksi maht
  
• Vt -täidise kogumaht ehk üldmaht ehk Vt= Vv + Vs + Vg
  

Kui juhtida läbi geelkromatograafia kolonni erineva molekulmassiga ainete segu, siis molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt vastavalt molekulide võimele difundeeruda geeli pooridesse. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse kolonni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Fraktsioonides sisalduvate ainete kontsentratsiooni määramiseks kasutatakse füüsikalisi ja keemilisi analüüsi meetodeid .
Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.
Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist kõige kiiremini, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin , Vxmin= Vv.
Küllalt väikse molekulmassiga ained, mis täielikult difundeerub geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, VxmaxVt.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit:

• kolonni vaba mahtu Vv ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu,
  
• maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad.
  

Liikuvusteguriga Rf iseloomustatakse aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud,
Aine kontsentratsiooni eluaadi fraktsioonides ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks. Ainete väljumis- ehk elueerumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerumis-mahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem.
Töö käik:
Märkisin üles kolonni iseloomustavad suurused.
Avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahusel lasin voolata kolonni kuni vedeliku tase langes täidise pinnani. Samal ajal reguleerisin kolonni voolukiirus umbkaudu kiiruseni 0,7-1,0 ml/min.
Segu doseerisin kolonni 0,5 ml. Segu koosneb 2 mg/ml dekstraansinisest; 1,5 mg/ml müoglobiinist ja 0,3 mg/mlDNP-aspartaadist.
Kui proov oli liikunud täidisesse lisasin pipeti abil geeli pinnale väikese kogus voolutit ja lasin sellel sisse imbuda. Siis kandsin geeli pinnale suurema kogus voolutuslahust, lisasin seda pidevalt vastavalt vajadusele. Avasin väljavoolu ning hakkasin koguma voolutit, kuni kõige kiiremini liikuv lahuse komponent jõudis kolonni alaossa. Ühendatud fraktsiooni mahu mõõtsin pärast.
Alustasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Elueerimise lõpetasin, kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks.
Fraktsioone analüüsisin spektrofotomeetri abil. Igal ainel oli oma neeldumismaksimum. Täiesti värvusetute fraktsioonide optilise tiheduse väärtused võrdusid 0-ga ja neid polnud vaja mõõta.
Tulemused:
• Kolonni täidiseks on Sephadex’i G-75, iseloomustav pundumistegur k on 0,1
• Geelisamba kõrgus L=33 cm ja diameeter d=1,6 cm
• Täidise kogumaht Vt=L*п*=33* п*=66,35 ml
• Geelimaatriksi maht Vg = k • Vt=0,1*66,35=6,635 ml
maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt– Vg= 66,35-6,635=59,715 ml
• Fraktsioonide üldarv n, ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vxmax/2=59,715/2=30
• Elueerimislahus 20 mM Tris/HCl 0,15 M NaCl pH 7,4
Fraktsiooni nr
Optiline tihedus, A
Elueerumismaht
V, ml
ühendatud fraktsioon
0
2 Lainepikkusel 670 nm
0
1
0,0463
22
2
0,1993
24
3
0,0706
26
4
0,0092
2 Lainepikkusel 410 nm
8
5
0,649
30
6
0,6954
32
7
0,4359
34
8
0,1866
36
9
0
38
10
0
40
11
0
42
12
0
44
13
0
46
14
0
48
15
0
50
16
0
52
17
0,2543
54
18
0,5322
5 Lainepikkusel 360 nm
6
19
0,6914
58
20
0, 5555
60
21
0,2981
62
22
0,176
64
23
0,0358
66
Oma vihikusse olin ma praktikumi ajal nii kirjutanud. Fr 15 ja 16 paistsid olevat värvusetud ning ma ei hakanud neid mõõtma. Mõõtmisi tehes ma ei mõelnud, milline võiks mu kromatogramm välja näha. Pidasin tähtsaks, et saan kätte Vxmin, Vx, Vxmax.
Vxmin
Vxmax
Vx
Vxmin=Vv=24 ml. Eluaadi kogumaht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni.
Dekstraansinise elueerumismaht on võrdne kolonni vaba mahuga, kuna tema molekulmass on 200 kDa ning ta ei mahu geeli pooridesse ja liigub pooridevahelisel alal, kuivõrd antud geeli lahutuspiirkond on ... 3000- 80000 Da.
Dekstraansinine väljus esimesena, kuna tema molekulaarmass on suurim ja ta ei mahtunud geeli pooridesse. DNP- aspartaat on väikseima molekulaarmassiga ning ta difundeerus täielikult pooridesse ja läbis seetõttu kolonni kõige aeglasemalt. Kuna geelkromatograafia põhimõtte on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi, siis järeldan ka, et ma ei tegelenud praktikumis mustkunstiga ning sain ootuspärased tulemused, kus kõige suurema molekulmassiga aine väljus esimesena ning kõige väiksema molekulmassiga väljus viimasena. Dekstraansinine 200 kDa, müoglobiin 16 800 Da ja DNP-aspartaat 299,5 Da. Antud geeli lahutuspiirkond on 3000-80000 Da.
Eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx=32 ml
Katseliselt sain Vxmax 58 ml, mis sobib arvutuslikult saadud 59,7 ml-ga.
Liikuvusteguri Rf väärtus müoglobiini jaoks:
Rf==0,22