AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL (0)

Tallinna Tehnikaülikool
TTÜ keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Laboratoorne töö 2.1
AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL
Õppejõud: Priit Eek, Kaia Kukk
Tallinn 2013

Sisukord

Sissejuhatus 3
Teoreetiline osa 4
Töö käik 5
Kolonni iseloomustamine 5
Töö kolonniga 6
Katseandmete tabel 7
Kromatogramm 8
Kromatogrammi järeldused 8
Liikuvusteguri Rf arvutamine 9
Järeldused 9
Kasutatud kirjandus 10

Sissejuhatus

Viienda praktikumi (1. aprill 2013) jooksul sooritati laboratoorne töö 2.1, mille teemaks oli ainete lahutamine geelkromatograafia meetodil.
Töö sisuks oli geelkromatograafia kolonni ettevalmistamine, uuritava proovi kolonni sisestamine ja kolonni voolutamine. Töö nõudis pidevat tähelepanu, kuna voolutuslahust tuli juurde lisada iga paari minuti tagant, et kolonn kuivaks ei jääks. Samuti tuli vahetada kalibreeritud katseklaase, et koguda fraktsioone täpselt 2 ml kaupa. Töö viimases faasis mõõdeti iga fraktsiooni optiline tihedus spektrofotomeetril.
Järgnevalt on toodud geelkromatograafia teoreetiline osa, seejärel töö käik, tulemused ning järeldused.

Teoreetiline osa

Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva ehk mobiilse ja liikumatu ehk statsionaarse faasi vahel.
Geelkromatograafia põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peenetralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Suurema molekulmassiga ained ei difundeeru geeli pooridesse ning seetõttu liiguvad nad kolonnis kiiremini ja väljuvad esimesena. Väiksema molekulmassiga ained difunteeruvad geeli pooridesse ja liiguvad seetõttu läbi kolonni aeglaselt.
Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, kusjuures proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. Joonis 1: Geelkromatograafia põhimõte
Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis – kolonnis, mis on täidetud pundunud geeligraanulitega.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:

Vv – kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht. Kolonni vaba maht on võrdeline minimaalse elueerimismahuga Vxmin (väljub kolonnist esimesena).

VS – graanulitesisese vedeliku maht

Vg – geelimaterjali ehk maatriksi maht

Vt – täidise kogumaht ehk üldmaht. On arvväärtuselt lähedane maksimaalse elueerimismahuga Vxmax.

Töö käik

Kolonni iseloomustamine

Kasutusel on geelkromatograafia kolonn nr 3 ( aknast kõige kaugemal).
Kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark
G-75
k = 0,1
Fraktsioneerimispiirkond: 3000 – 80000 D
Materjal: dekstraan
Täidise kõrgus L = 33 cm
Täidise diameeter d = 1,8 cm ; r = 0,9 cm
Täidise kogumaht
Geelmaatriksi maht
Maksimaalne elueerimismaht
Fraktsioonide üldarv
Voolutuslahuse koostis
50 mMTris-HCl
150 nM NaCl
pH = 7,5
Uuritava proovi koostis
Dekstraansinine (sinine)
Müoglobiin (pruun)
DNP- aspartaat (kollane)

Töö kolonniga

Kõigepealt avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et voolutuslahuse nivoo oleks võrne täitegeeliga. Samal ajal reguleeritakse kolonni voolukiirus reguleerimisklambri abil õigeks (soovitav voolukiirus 0,7-1,0 ml/min, millele vastab 1 tilk nelja sekundi jooksul). Voolutuslahus kogutakse väiksesse keeduklaasi ja visatakse pärast minema. Seejärel lisatakse kolonni uuritav proov.
Pipetti võetakse 0,5 ml uuritavat proovi (koostis kirjas eespool ). Pipeti ots peab olema kolonni keskel, umbes poole cm kaugusel geeli pinnast. Proov kantakse geeli pinnale võimalikult ühtlaselt.
Pärast proovi lisamist avatakse väljavool kolonnist ja lisatakse väike kogus voolutuslahust. Seda korratakse mõned korrad ning alles siis lisatakse voolutuslahust terve kolonni täitumiseni. Voolutuslahust peab esialgu lisama väikeste koguste kaupa, et kogu uuritav proov ühtlaselt geeli sisse läheks. Voolutuslahust tuleb lisada pidevalt, et kolonn kuivaks ei jääks.
Kõigepealt kogutakse eluaat väiksesse keeduklaasi. Ühendatud fraktsiooni maht on 23 ml. Eluaadi kogumist 2 ml fraktsioonide kaupa alustatakse veidi enne dekstraansinise väljumist. Seejärel kogutakse eluaati 2 ml fraktsioonide kaupa eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse kuni pärast viimase, kollase aine väljumist on eluaat värvusetuks muutunud. Kokku kogusin eluaati 37-sse katseklaasi. Arvutuste järgi oleks pidanud kasutama (75,58-23)/2 = 27 katseklaasi. 27 katseklaasi kogusin aga kõige intensiivsema kollase värvusega ainet. Ei oska öelda, millest võis selline mahtude vahe tekkida.
Edasi mõõdetakse fraktsioonide optilised tihedused spektrofotomeetriga. Tulemused on kantud järgnevasse tabelisse.

Katseandmete tabel

Fraktsiooni nr
Elueerimismaht
V, ml
Optiline tihedus, A
λ = 670 nm
λ = 410 nm
λ = 360 nm
Ühendatud fraktsioon
23
0
1
25
0,033
2
27
0,330
3
29
0,541
4
31
0,182
0,238
5
33
0,039
0,334
6
35
0,027
0,978
7
37
1,752
8
39
1,988
9
41
1,701
10
43
1,101
11
45
0,607
12
47
0,313
13
49
0,147
14
51
0,061
15
53
0,024
16
55
0
17
57
0
18
59
0
19
61
0
20
63
0
21
65
0
22
67
0,013
23
69
0,024
24
71
0,057
25
73
0,182
26
75
0,476
27
77
0,922
28
79
1,309
29
81
1,413
30
83
1,138
31
85
0,705
32
87
0,305
33
89
0,121
34
91
0,064
35
93
0,029
36
95
0
37
97
0

Kromatogramm

Kromatogrammi järeldused

Kõige kiiremini elueerunud aine, dekstraansinise elueerumisprofiil on kujutatud sinisega . Dekstraansinine väljub esimesena, sest selle molekulid on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse. Minimaalne elueerimismaht ehk maht, mille juures väljub dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktisioon, on 29 ml.
Järgmiseks on punasega kujutatud müoglobiini elueerumisprofiil. Tegu on geeli pooridesse osaliselt difundeeruvate molekulidega. Eluaadi maht Vx on 39 ml.
Viimasena on rohelisega kujutatud kollase aine DNP- aspartaadi elueerimisprofiil. Selle molekulid olid kõige väiksemad; aine väljus kolonnist viimasena. Maksimaalne elueerimismaht oli katse järgi 81 ml.
Varasemate arvutuste järgi sain Vxmax = 75,58 ml. Ei oska täpselt öelda, millest selline erinevus võis tekkida. Ühe võimalusena pakuksin välja, et esialgne voolukiirus oli ettenähtust mõnevõrra kiirem, kuid reguleerisin selle mõne minuti jooksul uuesti täpseks. Pole kindel, kas see võis katse tulemust mõjutada. Küll aga võis seda tulemust mõjutada väike erinevus fraktsioonide mahtudes. Paratamatult oli mõne fraktsiooni maht silma järgi mõõtes pisut suurem või väiksem kui 2 ml. Pigem oli mõni suurem ja rohkem väiksemaid.

Liikuvusteguri Rf arvutamine

Valem:
Arvutamisel kasutan Vxmax arvutuslikku väärtust 75,58 ml.
Müoglobiini liikuvustegur on 0,21.

Järeldused

Liikuvusteguri Rf väärtus müoglobiinile on 0,21, mis jääb nõutud vahemikku 0...1. Loen arvutuse ja katse õnnestunuks.
Samuti jään rahule koostatud kromatogrammiga. Graafikute erinevad kõrgused on tingitud vaid erinevatel lainepikkustel mõõtmistest. Graafiku üleminekud on sujuvad.
Loen ainete lahutamise õnnestunuks.

Kasutatud kirjandus

Malle Kreen , Terje Robal , Tiina Randla „Biokeemia laboratoorsed tööd“ , Tallinn 2010
Joonised
Joonis 1: http://cnx.org/content/m34657/latest/image3b.jpg