Ainete lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

Tallinna Tehnikaülikool
2.1 Ainete lahutamine geelkromatograafia meetodil
Liina Reimann
134537KATB
Kromatograafia- segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse laialdaselt aminohapete, valkude, süsivesikute jt ainete segude lahutamisel.
Geelkromatograafia on meetod erinevate suurustega molekulide eraldamiseks segust . Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse, tulevad kolonnist läbi esimesena. Kõige väiksemad molekulid aga takistuvad pooridesse, ning väljuvad geelist viimastena. Geelkromatograafias protsess viiakse läbi kinnises süsteemis- kolonnis . Kolonn on täidetud geeliga, ,mille pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakriilamidist.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustasid järgmised mahud:
Täidise maht (Vt), kolonni vaba maht (Vv), graanulitesisese vedeliku maht (Vs), geelimaterjali maht (Vg)
Uuritava segu läbi kolonni transportimiseks ja erineva molekulmassiga ainete eraldamiseks, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega ( puhver , soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa.
Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest.
Vx – eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.
Vxmin - ehk minimaalne elueerimismaht , mis on võrdne kolonni vaba mahuga
Vv –kolonni vaba maht ( kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena.)
Vxmax - maksimaalne elueerimismaht (aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt.)Vxmax = Vt – Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht. Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf
Rf =
Kromotogramm - kromotograafia protsessi visuaalne väljund, see on graafiline sõltuvust eluaadi fraktsioonides sisuldava aine kontsentratsioon ja eluaadi mahu vahe.

Töö käik

Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine

• Tööd teostasin kolonni juures nr 2. Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1.
  
• Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 23,3 cm ja diameetri D = 1,6 cm. Arvutasin täidise kogumahu Vt = = 0,82*23,3* cm3
  
• Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k Vt = 0,1*46,85= 4,685 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg = 42,162 cm.
  
• Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 42,165/2≈21.
  
• Võtsin 21 kaliibritud katseklaasi
  
• Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5,
  
• Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks.
  

Segu komponentide lahutamine

• Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP- aspartaat 0,3 mg/ml
  
• Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min
  

Proovi sisestamine

• Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale.
  
• Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine , väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 50 ml kuiva kolbi. Mõõtsin selle, sest see moodustab osa dekstraansinise elueerimismahust Vxmin . Kolvis olevat üldist fraktsiooni oli 12,5 ml.
  
• Lisasin puhverlahust mööda kolonni külge , seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi.
  
• Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2 ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. Kokku oli 21 katseklaasid.
  
• Kui sinise, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga.
  

Fraktsioonide analüüsimine

• Mõõtsin fraktsioonide optilised tihedused, et teada saada ainete kontsentratsioonide mõõdud. Selleks kasutasin spektrofotomeetrit. Mõõtsin ainult neid fraktsioonid, milles võib silma järgi täheldada värvust, sest täiesti värvusetute fraktsioonide optilised tihedused on 0.
  
• Eluaadi maht kolvis oli Vv=12,5 ml. Kuna fraktsioone koguti 2 ml kaupa, siis iga järgmise fraktsiooni maht suureneb sellest 2 ml võrra.
  

Lainepikkus (nm)
Fraktsiooni nr.
Elueerimismaht V, ml
Optiline tihedus, A
670
dekstraansinine
1
12,5
0,0018
2
14,5
0,4825 Vxmin
3
16,5
0,1769
4
18,5
0,0232
410
müoglobiin
5
20,5
0,5584
6
22,5
1,2058
7
24,5
1,6903
8
26,5
1,7195 Vx
9
28,5
1,2481
10
30,5
0,6880
11
32,5
0,2920
360
DNP- aspartaat
13
36,5
0,5283
14
38,5
1,1030
15
40,5
1, 6161
16
42,5
1,7673 Vxmax
17
44,5
1,4272
18
46,5
0,8711
19
48,5
0,4599
20
50,5
0,2351
21
52,5
0,0721

• Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine, see tähendab et tal on kõige suurem molekulaarmass. Järgmisena lahkus müoglobiin ja viimasena DNP-aspartaat, mis sisenes geeli pooridesse ning seetõttu väljus maksimaalse elueerimismahuga.
  
• Eluaadi kogumaht kuni dekstransinnise kõrgema konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vxmin = Vv = 14,5 ml.
  
• Eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 26,5 ml.
  
• Eluaadi kogumaht DNP- aspartaat kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vxmax = 42,5 ml.
  
• Arvutuslik eluaadi maht on Vxmax=42,615 ja mõõdetud on Vxmax = 42,5 erinevus ei ole liiga suur, see tähendab et töökaitse õnnetus hästi.
  
• Liikuvustegur Rf väärtus segus sisaldanud valgu (müoglobiin) jaoks:
  

Rf = =

Järeldus

Töö õnnestus hästi, sest arvutuslik ja mõõdetud eluaadi mahud erinesid väga vähe. Kolonnis oli näha kolme värvi(sinine, pruun, kollane), see tähendab, et segus oli 3 erinevat ainet ja need lahutusid üksteisest erineva kiirusega Kõige madalama molekulmassiga dekstraansinine väljus esimesena, sest tema osakesed olid liiga suured geeli pooride mahutamiseks Teisena väljus müoglobiin ja kolmandana kõige kõrgema kontsentratsiooniga DNP-aspartaat.