Laboratoorne töö 2.2 (1)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
KEEMIAINSTITUUT
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL3312 Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö
2. Segude lahutamine ja ainete identifitseerimine
2.2. Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
TALLINN 2010
2. SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE
2.2 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL
Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel.
Geelkromatograafia on meetod, mis tugineb lahuses sisalduva erineva molekulmassiga ainete erineval liikuvusel läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Selle meetodi puhul kasutatakse pundunud geeligraanulitega täidetud kolonne ja geeli pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse, s.t. vastavalt molekuli suurusele. Antud kolonn sisaldas Sefadex G75 geeli.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised suurused:

• Täidise maht ( Vt)
  
• Kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht (Vv)
  
• Graanulitesisese vedeliku maht (Vs)
  
• Geelimaterjali ( maatriksi) maht (Vg)
  

Vt=Vv+Vs+Vg
Ainet iseloomustavad:
Elueerimismaht ehk väljumismaht Vx. Ehk siis eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured, mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena. Tegemist on minimaalse elueerimismahuga Vxmin, kusjuures Vxmin=Vv. Ained, mis difundeeruvad täielikult geeli pooridesse liiguvad aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on lähedane antud kolonni kogu mahule. Vxmax= Vt-Vg.
Molekule, mis mahuvad geeli pooridesse sisenema, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile.
Töö käik:
Mõõtsin ära kolonni kõrguse ja diameetri , et arvutada fraktsioonide üldarvu.
Kolonni kõrguseks mõõtsin ma 31,4cm ja diameetriks1,8cm. k oli antud ja see oli 0,1. Vastavalt valemitele arvutasin:
Sain siis, et fraktsioonide üldarvuks tuleb 36.
Seejärel eemaldasin kolonni ülaosast üleliigse vedeliku lastes sel voolata mööda kolonni väiksesse keeduklaasi. Kui vedeliku nivoo oli geelisambaga peaaegu samal kõrgusel ( umbes 2mm kõrgemal) siis sulgesin kraani ja doseerisin pipetiga geelisamba pinnale 0,5ml uuritavat proovi. Proov koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine , müoglobiin ja DNA- aspartaat . Seejärel keerasin kraani vaikselt tilkuma ja panin sinna alla kolvi. Kui uuritav proov oli geeli imendunud, lisasin natuke juurde puhvrit, seejärel uuesti väikese koguse ja lõpuks lisasin rohkem, et puhvri maht ulatuse kolonni ääreni. Lasin eluaadil kolbi tilkuda seni, kuni esimene värviline riba ( sinine) jõudis kolonni põhjani ja eemaldasin siis kolbi ja kogusin edasi vedelikku fraktsioonidena nummerdatud ja kaliibritud(2ml) katseklaasidesse. Fraktsioone kogusin seni, kuni eluaadi värvituks muutumiseni ja oli näha, et kogu värviline osa oli ka kolonnist eemaldunud. Seejärel mõõtsin värviliste fraktsioonide optilised tihedused spektrofotomeetriga.
Andmete analüüs:
Eluaadi maht kolvis oli Vv= 23,5ml. Siis vastavalt iga järgmine fraktsiooni maht suureneb sellest 2ml võrra.
Lainepikkus
(nm)
Fraktsiooni
number
Eluaadi
maht (ml)
Optiline
tihedus
(ABS)
670
1
25,5
0,094
2
27,5
0,487
3
29,5
0,357
4
31,5
0,06
410
10
41,5
1,386
11
43,5
1,964
12
45,5
2,157
13
47,5
1,896
14
49,5
1,393
15
51,5
0,909
16
53,5
0,485
360
24
69,5
0,267
25
71,5
0,575
26
73,5
1,028
27
75,5
1,424
28
77,5
1,536
29
79,5
1,317
30
81,5
0,917
31
83,5
0,542
32
85,5
0,275
33
87,5
0,147
Kromatogramm
Vxmin Vx Vxmax
Vxmin on eluaadi maht, kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Vx on eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni ja Vxmax on eluaadi kogumaht kuni DNA- aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Leian liikuvusteguri Rf .
Järeldus:
Töö õnnestus enam vähem normaalselt. Käesolevas lahuses olevad komponendid eraldusid antud järjekorras kuna nende ainete molekulmassid liiguvad kolonni erineva kiirusega. See on tingitud ainete molekulide erinevast jaotumisest geeli pooridesse ja molekulide suurusest . Esimesena väljus kõrgmolekulaarne dekstraansinine, peale seda müoglobiin ja seejärel väikse Mr-ga DNP-aspartaat. Sahharoos oleks tõenäoliselt väljunud umbes ühel ajal DNP-aspartaadiga kuna mõlemad on madalmolekulaarsed.
Erinevus teoreetilise ja saadud Vxmax-i vahel võis olla tingitud kolonni mahu määramiseks mõõdetud kõrguse ja diameetri leidmisel tehtud veast.