Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

Tallinna Tehnikaülikool Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Tallinn 2019 Töö eesmärk


Töö eesmärgiks oli ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil. See   on   võimalik   tänu   lahuses   sisalduvate   ainete   erinevate molekulmasside   tõttu.   Erineva   molekulmassiga   ained   liiguvad   läbi ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Proov transporditakse läbi geeli   vesilahuse   abil,   mis   aitab   erinevate   molekulmassidega   ainetel üksteisest   eralduda.   Suurema   molekulmassiga   ained   liiguvad   läbi   geeli kiiremini,   sest   need   ei   mahu   täidise   pooridesse   ära.   Väiksema molekulmassiga   ained   liiguvad   aga   aeglasemalt,   sest   nende   molekulid sisenevad  pooridesse   ja   liikumine   aeglustub.   Kogu   protsess  viiakse   läbi kolonnis.   Kogu   protsessei   käigus   on   võimalik   teha   kindlaks   iga   aine elueerimis- ehk väljumismaht. See on selline elulaadi maht, mille juures kolonnist   väljub   fraktsioon,   milles   vastava   aine   kontsentratsioon   on maksimaalne. Töö käik  Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine  Esmalt   märkisime  üles   Sephadex’i   margi=>  675  ja   seda iseloomustava teguri k=>0,1.  Seejärel mõõdetakse geelisamba kõrgus L=>12,5 cm ja ja diameeter d=>2,7 cm.   Arvutatakse täidise kogumaht Vt=>71,53 
 Arvutatakse   geelimaatriksi   maht   Vg   =   k   •   Vt=>7,15   ja   sellest   lähtuvalt   kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vx max = Vt – Vg=>64.38.   Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2=>32,19.  Katseklaasistatiivi asetatakse fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdatakse.   Seejärel pandi kirja eluent=> NaCl 0,15 M.
 Varutakse väike keeduklaas või seisukolb, kuhu kogutakse kolonni täidise pinnal olev eluent.


Segu komponentide lahutamine  Kui ettevalmistused said tehtud võis avada kolonni väljavooluava. Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kiiresti kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis uuritava proovi sisestamiseks.  Proovi sisestamine  Et proovi sisestada tuli võtta 1 ml mõõtpipett, millega pandi geeli pinnale, võimalikult ühtlaselt 0,5 ml uuritavat proovi. Sellel ajal pidi kolonni väljavooluava olema suletud.  Uuritavad segud  Uuritava seguna kasutasime selles praktikumis dekstraansinist, mis elueerub   minimaalse   väljumismahuga   ja   mille   järgi   saab   teada kasutatava kolonni vabamahu (Vx min = Vv ). Samuti sisaldas uuritav segu ka müoglobiini ja D-aspartaati. Kolonni voolutamine  Esmalt kogume kolonnist puhta vooluti ühte väiksesse keeduklaasi ja mõõdame selle mahu v=>15,45 ml.  Seejärel võime hakata koguma proove, kuid esmalt veendume, et kogu   proov   on   täidisesse   sisenenud,   lisades   sellele   tilkhaaval voolutit.   Kui proov on sisenenud, võib lisada suuurtemates kogustes voolutit.   Kui   esimene   värviline   riba   hakkab   jõudma   kolonni   alaserva   tuleb hakata koguma selle mahtu 2 ml fraktsioonide kaupa.   Kolonni täidise kohal peab olema koguaeg piisavalt eluneti, et õhk ei pääseks kolonni.   Lõpuks kui kõik värvilisi fraktsioone enam ei tule võib võib prooide kogumise lõpetada.


Tulemused ja nende interpreteerimine A.  Täidise mark ja materjal=> Sephadex, 675  Täidist iseloomustav pundumistegur=> 0,1
 Täidise kõrgus=> 12,5 cm  Täidise sisediameeter=> 2,7 cm
 Täidise kogumaht=> 71.53 cm3  Maksimaalne elueerimismaht=> 64,38 cm3
 Fraktsioonide üldarv=> 32,19 B. Kromatogramm A- Müoglobiin B- D-aspartaat C- dekstraansinine V A B C 15,45 0 0 0 17,45 -0,0251 -0,0313 -0,0139 19,45 -0,0271 -0,033 -0,0164 21,45 -0,0168 -0,0225 -0,0055 23,45 0,0718 0,061 0,0783 25,45 0,03087 0,2615 0,2761 27,45 0,03448 0,2845 0,299 29,45 0,1667 0,1349 0,1509 31,45 0,0651 0,0401 0,0522 33,45 0,0773 0,021 0,0143 35,45 0,211 0,0614 -0,0003 37,45 0,4504 0,1394 -0,0052 39,45 0,6715 0,2157 -0,0061 41,45 0,7944 0,2574 -0,0068 43,45 0,7934 0,2563 -0,0076 45,45 0,689 0,2197 -0,0085 47,45 0,5321 0,1639 -0,0104 49,45 0,3735 0,1082 -0,0118 51,45 0,2326 0,0594 -0,0133 53,45 0,1466 0,0336 -0,0143


55,45 0,0869 0,0278 -0,0148 57,45 0,0669 0,0625 -0,0155 59,45 0,0832 0,147 -0,0159 61,45 0,1226 0,263 -0,0156 63,45 0,1716 0,3914 -0,0159 65,45 0,2097 0,4865 -0,0161 67,45 0,2093 0,4906 -0,0157 69,45 0,1801 0,4264 -0,016 71,45 0,1369 0,3305 -0,0158 73,45 0,0931 0,2344 -0,016 75,45 0,0559 0,1511 -0,0161 77,45 0,0293 0,0922 -0,0157 79,45 0,0096 0,0481 -0,0161 80,45 -0,0046 0,0165 -0,0158 10 20 30 40 50 60 70 80 90 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Kromatogramm A B C V (ml) A (nm) C.  Kõige   esimesena   väljus   kolonnist   dekstraansinine,   kõige   suurema molekulmassi tõttu. järgmisena väljus müglobiin millel on väiksem molekulmass   kui   dekstraansinisel,   kuid   suurem   kui   D-aspartaadil. Viimasena väljuski kõige väiksema molekulmassiga D-aspartaat.  Vxmin=Vv=> 27,45 ml
 Vx=> 41,45 ml


 Vxmax= 67,45 ml  D.  Arvutuslik Vxmax=> 64,38 cm3 ja viimasena väljunud komponendi Vxmax=> 67,45 ml, mis pole väga trastiliselt erinev. E. Rf = (Vx – Vx min) / (Vx max – Vx min)  Rf = (41,45-27,45)/(67,45-27,45)= 0,35