Geelkromatograafia (1)

Geelfiltratsioonikromatograafia ehk geelkromatograafia , mida tuntakse kui kui molekulaarsõelte meetodina, tugines lahuses sisalduvate erinevate molekulmassidega ainete erineval liikuvusel läbi peeneteralise võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Selle meetodi puhul kasutatakse pundunud geeligraanulitega täidetud kolonne. Geeli pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Geelid, mida seda liiki kromatograafias kasutatakse koosnevad dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Mina tegin antud protseduuri kolonnis nr 2 ja geeliks oli Sefadex G-50.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:
Täidise maht Vt
Kolonni vaba maht, st graanilitevahelise medeliku maht Vv
Graanilitesisese vedeliku maht Vs
Geelimaterjali maht Vg
Seega Vt= Vs+Vg
Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse. Ainet iseloomustab elueerimismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.
Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse siis väljuvad nad kolonnist kõige esimestena ja neil on minimaalne elueerimismaht, mis võrdub kolonni vaba mahuga ja tähistatakse Vxmin
vxmin=Vv
Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax.
Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületav kolonni kogumahtu.
Seega iseloomustavad mistahes geelkromatograafia kolonni kaks olulist suurust: Vv=Vxmin- vaba maht, mis on eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu.
Vxmax-maksimaalne elueerimismaht, mis on eluaadi maht, mille juures väljuvad need molekulid, mis on võimelised graanilitesse täielikult sisenema.
Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf, mis leitakse valemiga:
Rf= Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin
Töö käik:

Kolonn oli juba täidetud geeliga Sefadex G-50. Kolonni põhjas oli settinud täidist, seega võis avada väljavoolu, lastes üleliigsel vedelikul kolonnist välja tilkuda.
Oluline oli mitte kolonni lasta kuivaks joosta , sest muidu tungib õhk geelikihti. Reguleerida tuli ka voolukiirus 0,5-0,8 ml/min. Hiljem, kui siniselt värvunud molekulid olid geelist läbi tulnud, võis kiirust lisada.

Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 0,5ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas.

Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama , puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist : dekstraansinine, müoglobiin, DNP- aspartaat .

Lisasin puhverlahust, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi.

Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid.

Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga.
Arvutused:

Geelisamba kõrgus: 31cm
Diameeter : 2cm, raadius=1cm, seega kolonni maht: 3,14x31=97,34
k=0,1
geelimaatriksi maht Vg= 0,1x97,34= 9,734 ml
Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax= Vt-Vg: 97,34-9,734= 87,6ml
Fraktsioonide üldarv n= 2ml n= Vxmax/2 =87,6/2= 43,8
Kokku tuli 50 fraktsiooni, igaühes 2ml proovi, mõõtekolvis oleva vedeliku maht: 29 ml, seega teeb kokku 50x2= 100+29=129 ml
Vx= 29ml Rf=29-97,34/87,6-97,34=7,016
Proovide optilised tihedused:
Lainepikkus 670 nm (sinine)
1- 0
2- 0
3- 0,066
4- 0,142
5- 0,191
6- 0,188
7- 0,134
8- 0,077
( pruunid ) Lainepikkus 410 nm
9- 0,689
10- 0,806
11- 0,855
12- 0,864
13- 0,816
14- 0,744
15- 0,643
16- 0,535
17- 0,453
18- 0,349
19- 0,326
20-27- 0
( kollased ) Lainepikkus 360 nm
28- 0,179
29- 0,223
30- 0,281
31- 0,321
32- 0,378
33- 0,444
34- 0,486
35- 0,515
36- 0,518
37- 0,524
38- 0,515
39- 0,514
40- 0,429
41- 0,375
42- 0,349
43- 0,289
44- 0,256
45- 0,268
46- 0,168
47- 0,139
48- 0,106
49-50- 0
Kokkuvõte
Geelkromatograafia on meetod, mis võimaldab lahutada mitmekomponentseid segusid. Geeli poorid on samades mõõtmetes makromolekulidega. Mina kasutasin dekstraani geeli Sefadex G-50, ning kolonni, mis lahutas segusid aeglasemalt ja mitte nii hästi.
erineva molekulmassiga ainete üksteisest eraldamise eesmärgil koguti kolonnist väljuvat lahust kindla mahuga fraktsioonidena, ehk siis 2 ml kaupa ja nendes sisalduva aine kontsentratsiooni määramiseks kasutasin optilise tiheduse määramist. Fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks, antud töös kromatogramm koostatud käsitsi.
Kolonnis oli näha kolme värvi(sinine, pruun, kollane), see tähendas, et segus oli 3 erinevat ainet ja need lahutusid üksteisest erineva kiirusega. Fraktsioone tuli kokku 50 ja aega kulus antud töö tegemiseks umbes 3 tundi, koos optiliste tiheduste mõõtmistega. Antud töös nägin, kuidas ainete segu lahutamine sõltub kolonni omadustest, näiteks milline geel seal sees on.
Tallinna Tehnikaülikool
Biokeemia praktikum
Töö nr 2.2
Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
15.04.09
Maria Simmul
082619
YAGB -21
Juhendaja : Malle Kreen
Tallinn 2009