Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö nr.2.1
Anna Logunova YAGB-22
103347
Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Teooria
Geelkromatograafia on kromatograafia meetod,mis põhineb lahuses sisalduvate ainete lahutamisest ehk fraktsioneerimisest nende molekularmassi suuruse järgi. Lahuse erinevad ained liiguvad läbi geeli erineva kiirusega. Kiirus sõltub ainete molekulmassist . Geelkromatograafiat võib kasutada makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks.
Geelkromatograafiat tehakse kinnises süsteemis – kolonnis, kus on pundunud geeligraanulid, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega.
Geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:

• Kolonni vaba maht (Vv)
  
• Graanulitesisese vedeliku maht (Vs)
  
• Geelimaterjali maht (Vg)
  
• Täidise kogumaht (Vt)
  

Vt = Vv + Vs + Vg
Molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurustele ( võimele difundeerida geeli pooridesse). Et ained transportisid läbi kolonni ja eraldasid üksteisest, voolutatakse kolonni vesilahus ( nt soolalahus ) ja kolonnist väljuvat eluaati kogutatakse kindla arvu fraktsioonide kaupa.
Iga uuritavas segus oleval ainel on oma elueerimismaht Vx.
Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.
Suured molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse, väljuvad kolonnist esimesena ja on võrdsed kolonni vaba mahuga.
Vxmin = Vv
Väikese molekulmassiga ained liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax. Maksimaalne elueerimismaht on võrdne kolonni kogumahuga Vt.
Vxmax ~ Vt
Liikuvustegur Rf iseloomustab aineid, mis on võimelikud difundeeruda geeli pooridesse.
Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline graafiline sõltuvus.
Töö käik
Kolonni iseloomustramine ja ettevalmistamine:

• Kontrollin kolonni vertikalsust.
  

On vertikaalne.

• Märgin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark ja seda iseloomustav tegur k , mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest.
  

Sephadex G-75, pundumistegur k= 0,1.

• Mõõden geelisamba (täidise) kõrgus L ja diameeter d, kasutades sobiva joonlauda.
  

L=32,5 cm. d=1,9 cm.

• Arvutan täidise kogumaht Vt .
  

• Arvutan geelimaatriksi maht Vg .
  

• Arvutan kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax.
  

• Arvutan fraktsioonide üldarv n, arvestades, et ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml.
  

n= Vxmax/2 =82,89/2=41,445=~42

• Katseklaasistatiivi asetan fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan.
  
• Voolutuslahus: Dekstraansinine ,Müoglobiin,DNP- Aspartaat .Kasutasin automaatpipetti mahuga 0,5 ml.
  
• Kolonni pinnal olev eluent kogun seisukolbi.
  

Segu komponentide lahutamine:
Avan kolonni väljavooluava. Täidise lahus hakkab keeduklaasi tilkuma. Reguleerin kolonni voolukiirus piiridesse 0,7-1,0 ml/min. Kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletan kolonni väljavooluava .
Uuritav segu:
1.segu: Dekstraansinine (sinine), müüoglobiin (punane), DNP-aspartaat (kollane).
Proovi sisestamine:
Doseerimiseks kasutan automaatpipetti mahuga 0,5 ml. Viin 0,5 ml uuritavad segu kolonni vastu seina. Proov voolab geeli pinnale ühtlaselt. Avan kolonni väljavooluava ja kui uuritav segu on geeli sees lisan 2 ml eluenti.Kui kogu eluent on geeli sees ,lisan veel eluendi. Geelis olev proov moodustab sinist ja kollast kihti(punane oli nähtav ainult siis,kui kogusin katseklaasi.
Kolonni voolutamine:
Kolonnist tuleb puhas vooluti, mida kogun mõõtsilidrisse. Kokku tuli 20 ml ühendatud fraktsiooni.
Kui tuli sinine riba asendasin mõõtsilinder katseklaasiga ja hakkasin koguma fraktsioonid. Kokku tuli 42 fraktsiooni.
Fraktsioonide analüüsimine:
Analüüsin saadud fraktsioonide absortsiooni tihedused spetrofotomeetril. Dekstraansinine optiline tihedus vaatasin 670 nm lainepikkusel, müoglobiin- 410 nm, DNP-aspartaat- 360nm.Sisestan saadud andmed tabelisse.
Katseandmete tabel.
Fraktsiooni nr
Elueerumismaht, V ml
Optiline tihedus, A
Ühendatud fraktsioon
20
0
1
22
0,043
2
24
0,237
3
26
0,175
4
28
0,124
5
30
0,105
6
32
0,007
7
34
0,07
8
36
0,109
9
38
0,179
10
40
0,344
11
42
0,804
12
44
0,630
13
46
0,624
14
48
0,507
15
50
0,400
16
52
0,201
17
54
0,104
18
56
0,048
19
58
0,03
20
60
0,012
21
62
0,006
22
64
0,005
23
66
0,002
24
68
0,001
25
70
0
26
72
0,094
27
74
0,220
28
76
0,370
29
78
0,420
30
80
0,403
31
82
0,324
32
84
0,226
33
86
0,126
34
88
0,074
35
90
0,046
36
92
0,031
37
94
0,021
38
96
0,014
39
98
0,011
40
100
0,03
41
102
0,016
42
104
0,013
Tulemused ja nende interpreteerimine:

Kasutatud kolonni iseloomustavad parameetrid :

• Täidise material ja mark: Destraan Sephadex G-75
  
• Täidist iseloomustuv pundumistegur k : k=0,1
  
• Täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=32,5cm. d=1,9cm.
  
• Täidise kogumaht Vt : Vt=92,1cm3.
  
• Maksimaalne elueerimismaht Vxmax: Vxmax=82,89
  
• Fraktsioonide arv: n=42
  

B.Kromatogramm:
C. Kromatogrammil näidatakse:
Komponentid väljusid sellises järjekorras, sellepärast et Dekstraansinise molekulmass on kõige suurem, Müoglobiini molekularmass on suurem kui DNP-aspartaati molekulmass, aga väiksem kui Dekstraansinine. Kõige kiiremini väljuneb kõige suurema molekulmassiga aine. Kõige rohkem segus oli müoglobiini sisaldus, see on nähtav kromatogrammil. Dekstraansinine oli kõige väiksema sisaldusega aine segus.
Vxmin = 24 ml=Vv
Vx=46 ml
Vxmax=78 ml
D.
DNP-aspartaati elueerimis maht (78 ml) erineb arvutusliku Vxmax väärtusega (82,89 ml) umbes 4,89 ml järgi.
E.
Arvutan Rf väärtus.
Järeldus: Katse näitas,et geelkromatograafia abil on võimalik lahuses sisalduvate ainete lahutada,nende molekulmassi suuruse järgi. Vead võivad esineda arvutamise ümardumisel või kui kogusin fraktsioonid võis juhtuda olukord, kui võtsin vähem või suurem kogus eluenti.